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文檔簡介
1、棉花是世界上重要的經濟作物之一,棉花纖維為紡織工業(yè)提供了重要材料來源,因此分離鑒定與棉花纖維發(fā)育相關的關鍵基因,研究其表達模式及其對棉花纖維發(fā)育的調控機制,揭示棉纖維生長發(fā)育的分子遺傳基礎,對于改善棉花纖維品質具有重要的意義。
NAC轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子,在各種植物中廣泛存在。NAC家族成員在其N端含有一個保守的大約由150個氨基酸組成的NAC結構域,C端具有一個高度變異的轉錄激活區(qū)。已有的研究表明,NAC蛋
2、白參與了植物的生長發(fā)育和器官的模式建成,在植物信號轉導以及非生物損傷和脅迫應答過程中,NAC作為轉錄因子起激活或抑制應答的功能。近幾年的研究報道發(fā)現(xiàn),在擬南芥中許多的NAC轉錄因子參與了莖的次生壁發(fā)育過程,由于棉纖維強度主要由棉纖維次生壁加厚期決定的且其發(fā)育模式與擬南芥中纖維的發(fā)育模式也非常類似,因此篩選與棉纖維次生壁發(fā)育相關的轉錄因子,探究其在纖維發(fā)育過程中的調節(jié)機制,對于改善棉花纖維的品質具有十分重要的意義。
本實驗室
3、從棉花cDNA文庫中篩選并分離了多個NAC轉錄因子基因(包括GhNAC1-26),其中GhNAC1在棉花纖維中特異表達且在纖維次生壁加厚期表達量逐漸上升,而其它的NAC轉錄因子則是在各個組織中均有一定量表達。此外,GhNAC1與擬南芥莖中次生壁發(fā)育相關的轉錄因子NST1和NST3有很高的同源性。因此我們對棉花次生壁發(fā)育階段優(yōu)勢表達的GhNAC1做了重點分析。本文主要從基因結構特征、轉錄自激活活性、蛋白亞細胞定位、以及與次生壁發(fā)育的關系等
4、方面來研究闡述GhNAC1基因的功能。此外也對其它根優(yōu)勢表達的NAC轉錄因子與脅迫應答的關系進行了初步研究。取得如下研究結果:
1.GhNAC1具有典型的NAC家族轉錄因子的基因結構特征
通過PCR的方法從棉花20dpa fiber cDNA文庫中克隆得到GhNAC1基因的cDNA,并以棉花基因組DNA為模板分離克隆了GhNAC1基因的DNA全長序列。GhNAC1基因的ORF長1152 bp,編碼含有383個
5、氨基酸殘基的蛋白質,該蛋白N端具有保守的NAC結構域,包含A,B,C,D,E5個亞結構域,C端具有富含絲氨酸的轉錄激活結構域。GhNAC1基因全長序列共1346bp,含有3個外顯子和2個內含子,其中內含子插入的位點均遵守GT-AG規(guī)則,內含子1長66bp,其插入位點為編碼第90aa的密碼子內部;內含子2長128bp,插入在編碼第179aa與第180aa的兩個密碼子之間。該基因的外顯子和內含子數(shù)目與其它NAC家族的轉錄因子基因結構非常相似
6、,且其中前兩個外顯子編碼了NAC保守結構域,而第三個外顯子編碼為轉錄激活結構域。
2.GhNAC1具有轉錄自激活活性且自激活區(qū)域位于C端
根據GhNAC1基因的結構特點及其氨基酸序列的分析,分別構建了GhNAC1的PGBKT7-GhNAC1(Full)載體,PGBKT7-GhNAC1(NAC domain)載體,以及PGBKT7-GhNAC1(TAR)載體,轉化酵母AH109,分析其是否存在轉錄自激活現(xiàn)象。將
7、轉化得到的陽性單菌落分別在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade培養(yǎng)基上劃線生長,并進行x-gal的顯色反應,結果在轉入GhNAC1(Full)和GhNAC1(TAR)以后的酵母可以在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade培養(yǎng)基上正常生長,并且在加入x-gal后可以顯藍,而轉入對照以及GhNAC1(NAC domain)的只能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長,而不能在SD/-Trp/-Ade培養(yǎng)基上正常生長,且于x-gal反應不能顯藍。
8、從而證明了轉入GhNAC1(Full)和IGhNAC1(TAR)的酵母具有轉錄自激活的效應,并且其轉錄自激活結構域位于C端即第三個外顯子區(qū)域。
3.GhNAC1蛋白亞細胞定位于細胞核利用eGFP作為報告基因研究
植物蛋白的亞細胞定位是非常成熟且直觀有效的方法。構建了GhNAC1與eGFP的融合表達載體,分析GhNAC1的亞細胞定位。將GhNAC1-eGFP轉化擬南芥后獲得轉基因植株,利用激光共聚焦顯微技術,觀
9、察GhNAC1-GFP融合蛋白在轉基因擬南芥下胚軸中的定位情況,結果表明,GhNAC1定位于植物細胞的細胞核中。
4.過量表達GhNAC1轉基因擬南芥導致木質素的異位積累
為了研究GhNAC1在植物體內可能發(fā)揮的功能,分別構建了GhNAC1的過量表達載體pBI121-GhNAC1(Full)和pBI121-GhNAC1(NAC domain)并轉化擬南芥,獲得轉基因植株,通過RT-PCR驗證其在轉基因擬南芥植
10、株中得到了過量表達。通過與野生型相比較發(fā)現(xiàn),轉入了pBI121-GhNAC1(Full)的擬南芥葉子明顯向上卷曲,莢果發(fā)育不飽滿,且對其莖的間苯三酚染色結果顯示,與野生型相比莖的表皮細胞中出現(xiàn)了明顯的木質素異位積累的現(xiàn)象,同時,RT-PCR的分析表明,轉入了pBI121-GhNAC1(Full)的擬南芥與野生型相比,與次生壁發(fā)育相關的轉錄因子和次生壁多糖合成的相關基因的表達都發(fā)生了明顯的上調。而過量表達了GhNAC1(NACdomain
11、)的轉基因擬南芥則無此現(xiàn)象,與野生型擬南芥生長情況相似。
5.GhNAC1相互作用蛋白的篩選
為了分析GhNAC1在植物體內可能存在的網絡調控關系,應用酵母雙雜交技術,以GhNAC1(NAC domain)為誘餌蛋白,篩選棉花10dpa fiber cDNA文庫。測序結果顯示篩選得到的蛋白主要可以分為以下幾類,NAC蛋白,E2泛素化酶,核糖體蛋白,周期蛋白,以及一些未知蛋白等。根據上述結果,推測其中NAC蛋白
12、可能與GhNAC1轉錄因子形成二聚體發(fā)揮其功能,而E2泛素化酶可能對NAC蛋白功能起到調節(jié)作用。
6.棉花NAC基因在根中受各種脅迫的誘導表達
篩選得到了8個在根中優(yōu)勢表達的GhNAC基因,分別用100μMABA、250mMNaC1、20%PEG和低溫(4℃)處理5天齡棉花的根,分析GhNAC基因的表達是否受到這些脅迫因子的誘導。Real-time定量RT-PCR結果表明,GhNAC8,GhNAC10,GhN
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