轉錄因子NAC1在棉花纖維中的表達及在次生壁發(fā)育中的功能研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩76頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、棉花是世界上重要的經濟作物之一,棉花纖維為紡織工業(yè)提供了重要材料來源,因此分離鑒定與棉花纖維發(fā)育相關的關鍵基因,研究其表達模式及其對棉花纖維發(fā)育的調控機制,揭示棉纖維生長發(fā)育的分子遺傳基礎,對于改善棉花纖維品質具有重要的意義。
   NAC轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子,在各種植物中廣泛存在。NAC家族成員在其N端含有一個保守的大約由150個氨基酸組成的NAC結構域,C端具有一個高度變異的轉錄激活區(qū)。已有的研究表明,NAC蛋

2、白參與了植物的生長發(fā)育和器官的模式建成,在植物信號轉導以及非生物損傷和脅迫應答過程中,NAC作為轉錄因子起激活或抑制應答的功能。近幾年的研究報道發(fā)現(xiàn),在擬南芥中許多的NAC轉錄因子參與了莖的次生壁發(fā)育過程,由于棉纖維強度主要由棉纖維次生壁加厚期決定的且其發(fā)育模式與擬南芥中纖維的發(fā)育模式也非常類似,因此篩選與棉纖維次生壁發(fā)育相關的轉錄因子,探究其在纖維發(fā)育過程中的調節(jié)機制,對于改善棉花纖維的品質具有十分重要的意義。
   本實驗室

3、從棉花cDNA文庫中篩選并分離了多個NAC轉錄因子基因(包括GhNAC1-26),其中GhNAC1在棉花纖維中特異表達且在纖維次生壁加厚期表達量逐漸上升,而其它的NAC轉錄因子則是在各個組織中均有一定量表達。此外,GhNAC1與擬南芥莖中次生壁發(fā)育相關的轉錄因子NST1和NST3有很高的同源性。因此我們對棉花次生壁發(fā)育階段優(yōu)勢表達的GhNAC1做了重點分析。本文主要從基因結構特征、轉錄自激活活性、蛋白亞細胞定位、以及與次生壁發(fā)育的關系等

4、方面來研究闡述GhNAC1基因的功能。此外也對其它根優(yōu)勢表達的NAC轉錄因子與脅迫應答的關系進行了初步研究。取得如下研究結果:
   1.GhNAC1具有典型的NAC家族轉錄因子的基因結構特征
   通過PCR的方法從棉花20dpa fiber cDNA文庫中克隆得到GhNAC1基因的cDNA,并以棉花基因組DNA為模板分離克隆了GhNAC1基因的DNA全長序列。GhNAC1基因的ORF長1152 bp,編碼含有383個

5、氨基酸殘基的蛋白質,該蛋白N端具有保守的NAC結構域,包含A,B,C,D,E5個亞結構域,C端具有富含絲氨酸的轉錄激活結構域。GhNAC1基因全長序列共1346bp,含有3個外顯子和2個內含子,其中內含子插入的位點均遵守GT-AG規(guī)則,內含子1長66bp,其插入位點為編碼第90aa的密碼子內部;內含子2長128bp,插入在編碼第179aa與第180aa的兩個密碼子之間。該基因的外顯子和內含子數(shù)目與其它NAC家族的轉錄因子基因結構非常相似

6、,且其中前兩個外顯子編碼了NAC保守結構域,而第三個外顯子編碼為轉錄激活結構域。
   2.GhNAC1具有轉錄自激活活性且自激活區(qū)域位于C端
   根據GhNAC1基因的結構特點及其氨基酸序列的分析,分別構建了GhNAC1的PGBKT7-GhNAC1(Full)載體,PGBKT7-GhNAC1(NAC domain)載體,以及PGBKT7-GhNAC1(TAR)載體,轉化酵母AH109,分析其是否存在轉錄自激活現(xiàn)象。將

7、轉化得到的陽性單菌落分別在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade培養(yǎng)基上劃線生長,并進行x-gal的顯色反應,結果在轉入GhNAC1(Full)和GhNAC1(TAR)以后的酵母可以在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade培養(yǎng)基上正常生長,并且在加入x-gal后可以顯藍,而轉入對照以及GhNAC1(NAC domain)的只能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長,而不能在SD/-Trp/-Ade培養(yǎng)基上正常生長,且于x-gal反應不能顯藍。

8、從而證明了轉入GhNAC1(Full)和IGhNAC1(TAR)的酵母具有轉錄自激活的效應,并且其轉錄自激活結構域位于C端即第三個外顯子區(qū)域。
   3.GhNAC1蛋白亞細胞定位于細胞核利用eGFP作為報告基因研究
   植物蛋白的亞細胞定位是非常成熟且直觀有效的方法。構建了GhNAC1與eGFP的融合表達載體,分析GhNAC1的亞細胞定位。將GhNAC1-eGFP轉化擬南芥后獲得轉基因植株,利用激光共聚焦顯微技術,觀

9、察GhNAC1-GFP融合蛋白在轉基因擬南芥下胚軸中的定位情況,結果表明,GhNAC1定位于植物細胞的細胞核中。
   4.過量表達GhNAC1轉基因擬南芥導致木質素的異位積累
   為了研究GhNAC1在植物體內可能發(fā)揮的功能,分別構建了GhNAC1的過量表達載體pBI121-GhNAC1(Full)和pBI121-GhNAC1(NAC domain)并轉化擬南芥,獲得轉基因植株,通過RT-PCR驗證其在轉基因擬南芥植

10、株中得到了過量表達。通過與野生型相比較發(fā)現(xiàn),轉入了pBI121-GhNAC1(Full)的擬南芥葉子明顯向上卷曲,莢果發(fā)育不飽滿,且對其莖的間苯三酚染色結果顯示,與野生型相比莖的表皮細胞中出現(xiàn)了明顯的木質素異位積累的現(xiàn)象,同時,RT-PCR的分析表明,轉入了pBI121-GhNAC1(Full)的擬南芥與野生型相比,與次生壁發(fā)育相關的轉錄因子和次生壁多糖合成的相關基因的表達都發(fā)生了明顯的上調。而過量表達了GhNAC1(NACdomain

11、)的轉基因擬南芥則無此現(xiàn)象,與野生型擬南芥生長情況相似。
   5.GhNAC1相互作用蛋白的篩選
   為了分析GhNAC1在植物體內可能存在的網絡調控關系,應用酵母雙雜交技術,以GhNAC1(NAC domain)為誘餌蛋白,篩選棉花10dpa fiber cDNA文庫。測序結果顯示篩選得到的蛋白主要可以分為以下幾類,NAC蛋白,E2泛素化酶,核糖體蛋白,周期蛋白,以及一些未知蛋白等。根據上述結果,推測其中NAC蛋白

12、可能與GhNAC1轉錄因子形成二聚體發(fā)揮其功能,而E2泛素化酶可能對NAC蛋白功能起到調節(jié)作用。
   6.棉花NAC基因在根中受各種脅迫的誘導表達
   篩選得到了8個在根中優(yōu)勢表達的GhNAC基因,分別用100μMABA、250mMNaC1、20%PEG和低溫(4℃)處理5天齡棉花的根,分析GhNAC基因的表達是否受到這些脅迫因子的誘導。Real-time定量RT-PCR結果表明,GhNAC8,GhNAC10,GhN

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論