轉(zhuǎn)錄因子SOX2在食管鱗癌中的表達及功能研究.pdf

1、【背景】
　　食管癌是一類主要起源于食管鱗狀上皮和柱狀上皮的惡性腫瘤，在全球致死性疾病中排名第6位[1]。盡管食管腺癌近年來有增加的趨勢，但在世界上一些國家和我國仍以食管鱗癌為主[2]。食管癌確切病因尚未明確。轉(zhuǎn)錄因子SOX2定位于3號染色體上，以高度保守的高動力群（high-mobilitygroup，HMG）為特征，SOX家族蛋白（包括SOX2）通過它們的HMG結(jié)構(gòu)域結(jié)合特定的DNA序列激活或抑制靶基因的表達[3]。SOX2在

2、干細胞研究、早期胚胎發(fā)生、器官形成及神經(jīng)分化等重要事件中都起著關(guān)鍵的作用，從而引起了廣泛的關(guān)注。研究表明，SOX2參與食管癌[4]、胃癌[5]、結(jié)腸癌[6]、肺癌[7]和乳腺癌[8]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，SOX2在食管癌中的研究還不十分清楚。有關(guān)基因的表達調(diào)控的研究是生命科學的研究重點，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)在SOX2的啟動子區(qū)與Snail有多個結(jié)合位點，因而，我們推測是否SOX2與Snail通過相互作用參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。S

3、nail是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可通過抑制E-cadherin的表達誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Snail在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中起重要的調(diào)節(jié)作用。為了進一步了解SOX2在食管鱗癌中的作用，我們設(shè)計此實驗對SOX2與Snail在食管鱗癌中的表達相關(guān)性及其功能進行初步性探討。
　　【目的】
　　1.探討轉(zhuǎn)錄因子SOX2和Snail在食管鱗癌組織和細胞中的表達相關(guān)性。
　　2.構(gòu)建、鑒定SOX2的RNA干擾慢病毒載體及病毒的包裝、純化。

4、
　　3.初步探討SOX2在食道鱗癌中的功能。
　　【方法】
　　1.免疫組織化學方法檢測食管鱗癌、匹配癌旁組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中SOX2和Snail的表達，分析其與臨床病理資料的相關(guān)性。
　　2.Westernblot檢測SOX2和Snail在食管鱗癌細胞系EC109和EC9706中的表達。細胞免疫熒光觀察SOX2和Snail在食管癌細胞中的表達及亞細胞定位。
　　3.設(shè)計并構(gòu)建兩個SOX2shRNA載

5、體，測序鑒定正確后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細胞，Westernblot驗證干擾效率，干擾效果較好的序列構(gòu)建成帶GFP的SOX2shRNA慢病毒載體并包裝成慢病毒顆粒。
　　4.通過SOX2shRNA慢病毒感染EC109和EC9706，流式細胞儀無菌分選出GFP陽性細胞，Westernblot檢測SOX2表達變化。
　　5.Wst-1法繪制生長曲線、平板克隆形成實驗觀察感染SOX2shRNA病毒對食管癌細胞增殖的影響。

6、　　【結(jié)果】
　　1．SOX2和Snail在食管鱗癌組織和細胞中的表達。
　　1)SOX2在食管鱗癌組織表達陽性率為51％（29例/57例），明顯高于其匹配的癌旁組織16％（9例/57例），提示SOX2在食管鱗癌組織中表達增高（P<0.05）。另外在40例食管鱗癌及其相應的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中，SOX2在原發(fā)灶表達陽性率為45％（18例/45例），Snail的表達陽性率為68％（27例/40例），在轉(zhuǎn)移灶中SOX2表達陽性率為

7、28％（11例/40例），Snail為65％（26例/40例）。SOX2和Snail在食管鱗癌組織及其相應的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達具有正相關(guān)性（r=0.538,P<0.05）。
　　2)SOX2和Snail的在食管鱗癌組織中的表達與患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度和TNM分期等參數(shù)無顯著性差異（P>0.05）。
　　3)Westernblot結(jié)果顯示，SOX2和Snail均在食管癌細胞系EC109和EC9706中表達。細胞免疫

8、熒光觀察SOX2和Snail在EC109和EC9706中表達且共定位在細胞核。
　　2．成功構(gòu)建了兩個SOX2shRNA載體，測序結(jié)果正確。Westernblot驗證載體干涉有效，其中一個干涉效果較好的序列構(gòu)建成帶GFP熒光的慢病毒載體，包裝純化成慢病毒顆粒。
　　3．進一步探討SOX2在食管鱗癌發(fā)生與發(fā)展中的作用。
　　1)用SOX2shRNA慢病毒直接感染EC109和EC9706細胞，流式細胞儀分選出帶GFP的陽性

9、細胞，Westernblot證實成功獲得SOX2表達下調(diào)的穩(wěn)定細胞系。
　　2)免疫熒光檢測感染SOX2shRNA病毒的EC9706細胞中SOX2和Snail熒光強度均較感染陰性對照病毒的細胞減低。
　　3)Wst-1方法檢測不同感染細胞系的細胞生長狀況，結(jié)果顯示，下調(diào)SOX2表達的EC109和EC9706細胞生長速度減慢。
　　4)平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，感染SOX2shRNA病毒的EC109和EC9706細胞增殖