GhKNL1和GhMYBL1轉錄因子在棉花纖維發(fā)育中的功能研究.pdf

1、棉花作為世界上最重要的自然纖維和油料作物，產區(qū)遍布熱帶和亞熱帶地區(qū)。棉花用途多樣，可應用于紡織、食品、造紙等方面，具有很高的經濟價值。而且，由于棉纖維是外表皮單細胞突起并高度增長加厚的結果，成熟的棉纖維細胞壁的纖維素含量高達95％，這為研究細胞伸長、纖維素合成以及細胞壁發(fā)育提供了較為理想的模式系統(tǒng)。棉纖維發(fā)育可以分為起始、伸長、次生壁加厚和脫水成熟四個階段，起始期影響棉纖維密度，伸長期影響長度，次生壁加厚期影響棉纖維品質。我們從研究影響

2、棉纖維次生壁發(fā)育的基因入手，試圖揭示這些基因在棉纖維發(fā)育中的作用機制，為提高棉纖維產量和品質提供理論基礎。
　　在本實驗室先前工作的基礎上，本文研究GhKNL1和GhMYBL1兩個基因在棉纖維發(fā)育過程中的調控作用。圍繞GhKNL1 RNAi轉基因棉花展開對GhKNL1功能的進一步分析;同時將對于GhMYBL1的功能研究從模式植物擬南芥回歸到本體植物棉花中來，結合一些生化實驗，分析其在棉纖維發(fā)育中發(fā)揮的功能，取得的研究結果如下:

3、r>　　1、GhKNL1轉錄因子在棉纖維發(fā)育過程中發(fā)揮負調控作用
　　為了進一步研究GhKNL1基因在棉纖維發(fā)育過程中發(fā)揮的功能，構建了該基因的RNA干擾(RNAi)載體，轉化棉花，獲得轉基因棉花植株及其后代株系。對T1代轉基因棉花進行表型分析，結果表明，與野生型相比，GhKNL1 RNAi轉基因棉花纖維顯著伸長;去除長絨后，發(fā)現(xiàn)短絨的長度也有較為明顯的增加;脫絨后的種子在大小上有一定程度的變大。由此說明，GhKNL1參與調控棉纖

4、維發(fā)育過程，可能是作為轉錄抑制因子在棉花纖維發(fā)育中發(fā)揮負調控作用。
　　2、GhKNL1調控一些棉纖維細胞次生壁相關基因的表達
　　提取GhKNL1 RNAi轉基因棉花開花20天后(20 DPA)纖維RNA，利用熒光定量RT-PCR技術分析棉纖維伸長和次生壁加厚相關基因的表達量變化情況。結果表明，與野生型相比，棉纖維伸長相關的1，3-β-G基因表達略有上升，XTH基因表達量下調，而一些參與次生壁加厚期的基因表達量顯著上調，這

5、說明抑制GhKNL1基因表達會影響纖維細胞次生壁發(fā)育相關的基因表達，從而影響棉纖維細胞次生壁加厚發(fā)育。
　　3、GhMYBL1載體構建及棉花轉化
　　本實驗室在先前的工作中克隆鑒定了棉花MYB L1基因，并在擬南芥中初步分析了該基因的功能。為了進一步研究GhMYBL1在棉纖維發(fā)育中的作用，構建了CaMV35S啟動子驅動的GhMYBL1過量表達載體和該基因自身啟動子驅動的GhMYBL1過表達載體，GhMYBL1 RNAi載體，

6、以及GhMYBL1與GFP融合表達載體，用于轉化棉花。由于棉花轉化效率較低，且需要很長時間的愈傷組織繼代培養(yǎng)才能產生胚性愈傷組織及再生苗，因此這項工作尚在進行中。其中，兩個GhMYBL1過量表達載體轉化棉花，已獲得轉化愈傷組織，經過長時間繼代培養(yǎng)，預期可能在近期內獲得轉基因胚性愈傷組織及再生小苗;GhMYBL1∷GFP融合表達載體轉化棉花，已經獲得4個胚性愈傷組織細胞系，即將出苗;GhMYBL1 RNAi載體轉化棉花，獲得12個胚性愈傷

7、組織細胞系，其中6個胚性細胞系再生出苗。對所獲得的再生植株進行鑒定，在40棵小苗中，有25棵為轉基因陽性植株。將這些轉基因棉花植株移栽到土中，繼續(xù)生長發(fā)育，部分植株能夠正常發(fā)育，開花結實，收獲到T1代種子。將T1代種子萌發(fā)栽種在土中，初步分析了轉基因棉花植株表型，相關的實驗分析正在進行中。
　　4、GhMYBL1影響CelA1啟動子和IRX12啟動子活性
　　為研究GhMYBL1調控的基因類型以及調控方式，進行了擬南芥雜交實

8、驗，實驗用的轉基因植株為PC1301-CelA1p∷GUS(CelA1啟動子與GUS融合)和PC1301-IRX12p∷GUS(IRX12啟動子與GUS融合)轉基因擬南芥和GhMYBL1過表達轉基因擬南芥。實驗結果表明，PC1301-CelA1p∷G US轉基因擬南芥與GhMYBL1過表達擬南芥雜交后GUS信號增強，而PC1301-IRX12p∷GUS與GhMYBL1過表達擬南芥雜交后GUS信號變弱。上述結果說明GhMYBL1可以調控C

9、elA1和IRX12這兩個啟動子的活性。
　　5、GhMYBL1可以在體外直接作用于CelA1啟動子的SMRE順式元件
　　為了研究GhMYBL1轉錄因子是否能通過對順式元件SMRE基序的識別來調控目的基因表達，進行了凝膠遷移(EMSA)實驗。首先，在大腸桿菌中誘導表達GhMYBL1蛋白，通過純化得到純度較高的GhMYBL1蛋白;再根據(jù)CelA1啟動子序列中的SMRE序列設計探針，進行EMSA實驗。結果顯示，GhMYBL1蛋