dsdA新型篩選標(biāo)記系統(tǒng)及OsGLK1轉(zhuǎn)錄因子的功能研究.pdf

1、葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)以同源重組為契機(jī)，可以實(shí)現(xiàn)植物葉綠體基因組的特異性編輯。同時(shí)，葉綠體基因組拷貝數(shù)高、基因組結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控具有原核生物的特性，能夠以操縱子的形式調(diào)控多基因的表達(dá)。更為重要的是，大多數(shù)被子植物的葉綠體遺傳方式為母系遺傳。因此，葉綠體轉(zhuǎn)化可以有效的克服核轉(zhuǎn)化中的花粉漂移、基因沉默、位置效應(yīng)、多基因轉(zhuǎn)化難等諸多弊端，已經(jīng)成為了植物遺傳育種中的一個(gè)重要策略。盡管葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在雙子葉植物中發(fā)展比較成熟，但是關(guān)于單子葉植物葉綠體轉(zhuǎn)化的

2、報(bào)道較少，其中缺乏有效的篩選系統(tǒng)是阻礙單子葉植物葉綠體轉(zhuǎn)化發(fā)展的重要因素之一。因此，找到可以在單子葉植物中廣泛使用的篩選標(biāo)記基因?qū)⒑蛢?yōu)化單子葉植物葉綠體轉(zhuǎn)化體系是至關(guān)重要的。
　　本研究對(duì)編碼D-絲氨酸(D-Ser)解氨酶的dsdA基因作為篩選標(biāo)記基因在煙草葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和水稻核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的可行性應(yīng)用展開了深入探討，為單子葉植物水稻的葉綠體轉(zhuǎn)化篩選系統(tǒng)提供了一個(gè)新型的有效候選基因。主要結(jié)果如下:
　　1、構(gòu)建了葉綠體特異

3、轉(zhuǎn)化載體pZF75-dsdA，通過基因槍轉(zhuǎn)化獲得了煙草葉綠體轉(zhuǎn)化植株。分子生物學(xué)分析表明dsdA基因已定點(diǎn)整合到了煙草葉綠體基因組中且達(dá)到同質(zhì)化，表達(dá)量高。轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的正反交遺傳試驗(yàn)證明dsdA基因的遺傳遵循母系遺傳規(guī)律。
　　2、用三種方法分別對(duì)煙草葉綠體轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了D-Ser的抗性測(cè)試，結(jié)果表明與野生型煙草相比，煙草轉(zhuǎn)化植株對(duì)D-Ser的抗性顯著增強(qiáng)，用于種子發(fā)芽、愈傷及植株的有效的D-Ser篩選濃度分別為:10

4、mM、30 mM和75 mM。揭示出dsdA基因可以作為煙草葉綠體轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記基因。
　　3、通過分子鑒定篩選獲得了dsdA高表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合水稻植株。對(duì)dsdA高表達(dá)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行D-Ser的抗性測(cè)試，表明轉(zhuǎn)基因愈傷在75 mM D-Ser的篩選培養(yǎng)基上能繼續(xù)分裂產(chǎn)生新的愈傷，而野生型愈傷則停止生長(zhǎng)并逐漸褐化死亡。說明dsdA基因可以潛在的作為水稻核轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記基因。
　　4、對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的葉綠素含量，株高，根長(zhǎng)等性狀進(jìn)行

5、考察和統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料與野生型相比無明顯差異，說明dsdA基因在水稻中表達(dá)未對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育造成負(fù)面影響。
　　5、對(duì)五種常用水稻品種進(jìn)行了D-Ser敏感性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)以上五種水稻種子的萌發(fā)在10 mM D-Ser培養(yǎng)基上均受到了強(qiáng)烈抑制，在15 mM D-Ser培養(yǎng)基上的萌發(fā)被完全抑制;該實(shí)驗(yàn)說明了D-Ser作為非抗生素類篩選劑，能夠廣泛應(yīng)用于不同的水稻品種中。
　　愈傷組織中的前質(zhì)體與綠色組織中的葉綠體處于質(zhì)體發(fā)育分化

6、的不同階段，實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果表明其中基因的表達(dá)調(diào)控模式與機(jī)制并不相同，而愈傷分化發(fā)育問題是限制單子葉植物水稻的葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展的另一個(gè)重要因素。轉(zhuǎn)錄因子OsGLK1與葉綠體發(fā)育相關(guān)，異位超表達(dá)OsGLK1能夠促進(jìn)葉綠體在水稻非綠色組織細(xì)胞中的發(fā)育。為了深入研究轉(zhuǎn)錄因子OsGLK1基因在調(diào)控水稻葉綠體發(fā)育過程中的分子和生化機(jī)制，本研究構(gòu)建、獲得并鑒定了一系列重要研究載體和轉(zhuǎn)基因材料，為后期的葉綠體在水稻非綠色組織愈傷中的發(fā)育調(diào)控的研究，以

7、及單子葉植物葉綠體轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果概述如下:
　　1、構(gòu)建了原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表明GLK1目標(biāo)片段能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)，有利于進(jìn)一步完成蛋白純化和抗體制備。
　　2、完成GLK1-GFP融合載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化，并從58株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株中鑒定獲得了純合單拷貝家系，可用于下一步的染色體免疫沉淀分析(CHIP)。
　　3、對(duì)OsGLK1超表達(dá)植株和干涉植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀與