羊草乙醛脫氫酶基因的克隆及CBF2轉(zhuǎn)錄因子功能的研究.pdf

1、逆境脅迫(如干旱、高鹽、低溫等)是影響植物生長發(fā)育的主要因素，嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，并日益惡化生態(tài)環(huán)境。如何提高植物的抗非生物脅迫能力來滿足日益增長的糧食需求，已經(jīng)成為現(xiàn)代育種工作急需解決的關(guān)鍵問題之一。應(yīng)用基因工程手段開發(fā)耐逆資源，克隆耐逆基因，培育耐逆農(nóng)作物品種已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究的一個重要內(nèi)容，也是維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效策略。為了進一步探討植物抗逆反應(yīng)機理，本文以羊草、煙草和擬南芥作為主要實驗材料，開展了植物耐逆分子機制和相

2、基因工程研主要結(jié)果如下。 測定了灰綠型羊草的耐鹽相關(guān)生理指標，并與黃綠型羊草進行了比較，各種生理生化指標的變化趨勢充分反應(yīng)了灰綠型羊草是一個高抗鹽性材料，其中一定含有眾多的耐鹽基因。利用RT-PCR技術(shù)從來綠型羊草RNA中擴增到了3個通讀的且具有醛脫氫酶基因家族保守結(jié)構(gòu)域的序列LC-1、LC-2和LC-3。結(jié)構(gòu)上的同源性比較表明，LC-1為一種乙醛脫氫酶基因；LC-2 為甜菜堿醛脫氫酶基因；LC-3 為一個未知的全新的醛脫氫晦基

3、因。這三個序列在GenBank上的注冊號分別為DQ458294，DQ497618，DQ458293． 以LC-1為靶序列，采用RACE技術(shù)克隆到了全長1712bp的羊草乙醛脫氫酶基因LC-ALDH，該基因包括 1503bp 的 ORF，編碼501個氨基酸，含有66bp 的5’-UTR和144bp 的3’-UTR，在終止密碼子下游72bp處有單一的加尾信號AATAAA，在GenBank上的登陸號為 EF492045。經(jīng)生物信息學分

4、析，LC-ALDH 具有醛脫氫酶基因家族絕對保守的谷氨酸活性位點、半胱氨酸殘基和組氨酸殘基。與水稻的OsALDHla基因的同源性最高，氨基酸的一致性達到87％，系統(tǒng)發(fā)生學分析表明LC-ALDH屬于細胞質(zhì)的醛脫氫酶基因。Real Time RT-PCR 結(jié)果表明，LC-ALDH 基因受高鹽、干旱及低溫等逆境脅迫的誘導，并在這些誘導條件下其表達量顯著升高。推測該基因在抑制細胞膜脂過氧化反應(yīng)、抵御氧化脅迫的作用中起重要的作用。 利用P

5、CR 技術(shù)從擬南芥基因組中克隆了CBF2基因和rd29A 啟動子，并構(gòu)建了由rd29A 啟動子調(diào)控的 CBF2 基因的植物表達載體 pBI-RD-CBF<,2>，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草品種龍江851。轉(zhuǎn)基因植株后代遺傳學分析表明，外源基因以單拷貝的形式插入到煙草基因組中并遵循孟德爾 3:1 的遺傳分離規(guī)律；耐鹽性鑒定表明，轉(zhuǎn)基因煙草在150mM NaCl 脅迫下尚可正常生長，而野生型煙草在 100mM NaCl脅迫下鹽害癥狀明顯；電導