嗜冷細菌△9脂肪酸脫氫酶的基因克隆與功能研究.pdf

1、脂肪酸脫氫酶是生物體合成不飽和脂肪酸的關鍵酶之一，也是生物調(diào)節(jié)細胞膜組成與功能的重要酶，其研究日益受到重視。從動物、植物、真菌和藻類等不同生物體中克隆到脂肪酸脫氫酶基因，并獲得了功能性表達，但細菌來源的脂肪酸脫氫酶相關研究很少。本文篩選了土壤嗜冷細菌，研究了嗜冷細菌的分布及脂肪酸組分特征、嗜冷細菌△9脂肪酸脫氫酶的基因克隆與表達、酶相關性質(zhì)、酶系統(tǒng)進化與功能性氨基酸殘基鑒定等。
　　 采用15℃的培養(yǎng)條件，從低溫環(huán)境下的土壤樣品

2、中富集并分離到32株嗜冷細菌，其中革蘭氏陽性菌6株，革蘭氏陰性菌26株。根據(jù)細胞脂肪酸組成的多樣性，選擇具有代表性的11株細菌進行菌種鑒定與分類，它們分布在Psychrobacter、Pseudomonas、Pseudochrobactrum、Sphingobacterium、Arthrobacter、Bacillus和Pseudoalteromonas等7個屬。除1株只能鑒定到屬外，其余10株均可鑒定到種。革蘭氏陽性菌細胞脂肪酸中C1

3、5支鏈飽和脂肪酸的含量高于90％；革蘭氏陰性菌脂肪酸的不飽和度均超過50％，主要含不飽和的C16或C18直鏈脂肪酸，揭示了革蘭氏陽性菌和陰性菌不同的細胞膜脂肪酸組分的低溫適應機制。總結以上結果，本研究選擇了高不飽和脂肪酸含量的海洋嗜冷細菌Pseudoalteromonas haloplanktis M15及嗜冷細菌Psychrobacter urativorans DSM14009作為脂肪酸脫氫酶基因的供體菌。
　　 采用COD

4、EHOP PCR策略和改良的基因組步移方法快速高效地從Psy。urativorans DSM14009中克隆了△9脂肪酸脫氫酶的編碼基因PuFAD9(GenBankaccession no.EF617339)。該基因的氨基酸序列與Psychrobacter arcticus273-4推測的△9脂肪酸脫氫酶具有79％一致性，具有整膜脫氫酶特征性的疏水分布和三個組氨酸富集區(qū)。將PuFAD9基因轉化E.coli并誘導表達，目的蛋白的N端融合有

5、T7 tag，其分子量大約為60 kDa，主要定位于細胞膜。它具有△9脂肪酸脫氫酶活性，能催化細胞中棕櫚酸轉化為棕櫚油酸。在15℃下表達，重組菌C16脂肪酸中棕櫚油酸含量由34％增加到88％，而棕櫚酸含量由66％減少到12％。另外顯示培養(yǎng)溫度顯著影響細胞中不飽和脂肪酸的含量，25℃下誘導表達6 h，重組菌中棕櫚油酸與棕櫚酸的比率是15℃下表達的2.4倍，與該酶在兩個溫度下的表達水平一致。表明溫度影響脂肪酸脫氫酶的合成，從而影響棕櫚酸到棕

6、櫚油酸的轉化。37℃下盡管有蛋白表達條帶，但沒有觀察到棕櫚油酸的積累，很可能因為較高溫度下，脂肪酸脫氫酶的折疊可能受到影響。在25℃下誘導4 h，脫氫酶的蛋白表達量和in vivo活性最大。
　　 從嗜冷海洋細菌Pseu.haloplanktis M15中克隆到脂肪酸脫氫酶基因PhFAD9。該基因的一級序列與Pseu.haloplankits TAC125推測的脂肪酸脫氫酶序列(Genbank accession no.YP_3

7、41374)同源性高達99.7％，其第304個氨基酸由賴氨酸K突變?yōu)榫彼酭。系統(tǒng)發(fā)育分析證明該序列與其他海洋細菌的脂肪酸脫氫酶推測序列也具有很高的同源性。用HMMTOP、TMHMM、DAS、TMpred、SOSUI、TopPred和Phobius等七種在線軟件對其進行了跨膜螺旋預測。用Phobius軟件分析得到的Pseu.haloplanktis脂肪酸脫氫酶的膜拓撲學模型，與文獻報道的其他整膜脫氫酶的膜拓撲學模型一致。PhFAD9基因

8、在E.coli中表達的蛋白產(chǎn)物具有△9脂肪酸脫氫酶活性。25℃下誘導2 h后，重組菌C16脂肪酸的不飽和度達到91.7％，增加為對照菌中的近兩倍，棕櫚油酸與棕櫚酸的比率由對照菌中的0.9提高到11。
　　 來源于Psy.urativorans DSM14009和Pseu.haloplanktis M15的△9脂肪酸脫氫酶都能利用棕櫚酸和硬脂酸為底物，且更適于轉化棕櫚酸。硬脂酸并非E.coli宿主的主要內(nèi)源脂肪酸組分，培養(yǎng)基中預先

9、加入400μmol·L-1硬脂酸的條件下，在重組菌PuFAD9和PhFAD9的細胞總脂肪酸(硬脂酸除外)中分別檢測到4.3％和2.0％的油酸，顯示該類酶對硬脂酸的活性可能較低。
　　 比對了已報道的功能確定的整膜△9脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列，除藍細菌的第三個組氨酸富集區(qū)最后一個氨基酸殘基為酪氨酸Y，這類酶三個保守的組氨酸富集區(qū)特征為HRXXXH，XWXXXHRXHH，HNXHHXF。以藍細菌中A9脂肪酸脫氫酶作為外群，采用鄰近連

10、接法構建系統(tǒng)進化樹?！?脂肪酸脫氫酶主要分為藍細菌、植物、細菌、真菌和動物△9脂肪酸脫氫酶等5個單系群。確立了細菌脂肪酸脫氫酶的進化地位，對該類酶的深入研究具有一定的指導意義。
　　 根據(jù)多序列比對結果，將Psy.urativorans脫氫酶序列中功能未被驗證的保守殘基G212、H217、W220和S297分別突變?yōu)镠，N，G和K。25℃下誘導表達4 h后，用SDS-PAGE和蛋白印跡方法檢測到Psy.urativorans△9

11、脫氫酶和其突變酶都有表達。在培養(yǎng)基中添加或不加硬脂酸的條件下，表達野生酶的重組菌細胞脂肪酸中棕櫚油酸的含量分別為22％和26％，是棕櫚酸的1.5和1.8倍。而突變株的棕櫚油酸與棕櫚酸組成與不含脂肪酸脫氫酶基因的對照株接近。在添加硬脂酸培養(yǎng)的野生酶重組菌中還能檢測到4％的油酸，但從突變酶重組菌中未檢出油酸。表明G212H，H217N，W220G和S297K四處單點突變都能導致Psy。urativorans△9脂肪酸脫氫酶失活，說明G212