水稻ω-6脂肪酸去飽和酶基因克隆與功能研究.pdf

1、水稻是我國(guó)最主要的糧食作物之一,主要起源于熱帶和亞熱帶地區(qū),其地理分布主要受溫度的影響。不飽和脂肪酸是植物膜系統(tǒng)的重要組份之一,它在低溫條件下維持細(xì)胞功能和保護(hù)植物體方面起到重要的作用。因此,采用遺傳工程方法增加不飽和脂肪酸含量對(duì)培育水稻耐低溫育種的研究意義重大,刻不容緩。
　　本論文中采用RT-PCR的方法從水稻Dryza sativa L.葉片中克隆到編碼水稻內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω-6脂肪酸去飽和酶基因的開放閱讀框(ORF),全長(zhǎng)1167b

2、p,包含388個(gè)氨基酸,命名為OsFAD2(登錄號(hào):No.FJ768953)。BLAST檢索顯示它與其它物種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω-6脂肪酸去飽和酶基因(FAD2)具有較高同源性,氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其包含膜結(jié)合蛋白所特有的三個(gè)保守的組氨酸簇,在C末端存在著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位所必須的(-YNNKL)序列導(dǎo)肽,聚類分析顯示該基因?qū)儆诮M成型表達(dá)FAD2基因。
　　水稻OsFAD2為組成型表達(dá)基因,該基因在葉片中的表達(dá)量明顯高于其它器官。原位檢測(cè)結(jié)果表明:在根

3、中,在黑暗和冷脅迫條件下,OsFAD2的表達(dá)與對(duì)照相比在各個(gè)組織中分布無(wú)明顯變化;在葉中,黑暗處理?xiàng)l件下,OsFAD2在葉肉細(xì)胞和維管束組織中的表達(dá)量有所下調(diào),而冷脅迫條件下OsFAD2的mRNA主要在表皮細(xì)胞中積累。Real-time PCR結(jié)果顯示:受到在不同激素處理之后,OsFAD2基因的表達(dá)量上升。
　　構(gòu)建酵母真核表達(dá)載體pYES NT(C)-OsFAD2,經(jīng)醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1,通過(guò)缺尿嘧啶培養(yǎng)基篩選獲得多

4、拷貝陽(yáng)性克隆菌株。Western blot結(jié)果表明同源重組的酵母能正常表達(dá)含有目的基因的融合蛋白,同源重組酵母在4℃低溫下的菌落生長(zhǎng)狀況明顯好于空載轉(zhuǎn)化酵母,表明OsFAD2基因的轉(zhuǎn)入提高了酵母對(duì)低溫的耐受性。構(gòu)建蛙卵表達(dá)載體pT7TS-OsFAD2,采用顯微注射的方法轉(zhuǎn)入蛙卵細(xì)胞中,外源施加油酸2h之后,可以監(jiān)測(cè)到亞油酸的生成。
　　構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-OsFAD2,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將OsFAD2基因轉(zhuǎn)入擬

5、南芥fad2突變體中,經(jīng)潮霉素篩選獲得T3代轉(zhuǎn)基因種子。RT-PCR結(jié)果顯示水稻FAD2基因能夠互補(bǔ)擬南芥fad2突變體表型;同時(shí),將OsFAD2基因?qū)氲蕉i稻kasalath中,經(jīng)過(guò)潮霉素篩選獲得T2代轉(zhuǎn)基因種子,我們檢測(cè)了低溫條件下的水稻發(fā)芽率、電導(dǎo)率和Fv/Fm,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比,能夠顯著的耐受低溫脅迫。更為重要的是,過(guò)表達(dá)OsFAD2基因的水稻株系,在生殖生長(zhǎng)期能夠表現(xiàn)出顯著的耐寒性,低溫處理之后,產(chǎn)量比對(duì)照組高46％