溫度脅迫下番茄內質網(wǎng)ω-3脂肪酸去飽和酶基因的表達和功能研究.pdf

1、溫度是限制植物生長發(fā)育及地理分布的重要環(huán)境因子之一。當植物遭受溫度脅迫時，生物膜是傷害的初始位點。植物體膜脂不飽和脂肪酸含量越高，膜脂相變溫度就越低，低溫抗性就越強。反之，則相變溫度越高，高溫抗性越強。ω-3脂肪酸去飽和酶FAD3位于內質網(wǎng)膜上，負責質體膜內膜膜脂之外及非光合組織中所有不飽和甘油酯的合成，是不飽和脂肪酸合成途徑中催化18：2(9，12)轉化為18：3(9，12，15)的關鍵酶。本研究從番茄中分離到內質網(wǎng)(ω-3脂肪酸去飽

2、和酶基因。表達模式和功能分析表明，該基因的表達受低溫誘導，受高溫抑制。過量表達該基因增強番茄植株的耐冷性，而抑制該基因表達可提高番茄植株的耐熱性。主要結果如下： 1.利用同源序列設計簡并引物，先通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到內質網(wǎng)(ω-3脂肪酸去飽和酶基因的中間片段，然后采用RACE的方法分別克隆到5'片段和3'片段，拼接后設計特異引物擴增到全長cDNA。該基因全長為1184 bp，ORF為1134 bp，編碼377個氨

3、基酸，分子量約為41 kD。將其在GenBank注冊，注冊號為EU251190。 2.同源序列比較發(fā)現(xiàn)，番茄內質網(wǎng)ω-3脂肪酸去飽和酶基因的序列與煙草、油棕、大豆和芥菜型油菜的內質網(wǎng)型ω-3脂肪酸去飽和酶基因同源性很高。同時，進化樹分析表明，該基因聚類到內質網(wǎng)型FAD3類ω-3脂肪酸去飽和酶，因此將其命名為LeFAD3基因。結構同源性分析表明LeFAD3有四個序列保守的結構域，其中后三個保守區(qū)富含組氨酸，是維持其膜結合類酶特性所

4、必須的。 3.Southern雜交結果表明，LeFAD3基因在番茄基因組中是單拷貝的，是編碼番茄ω-3脂肪酸去飽和酶多基因家族中的一員。Northern雜交結果表明，LeFAD3基因在不同器官中呈非特異性表達，在非光合組織中表達量較高，尤以根系中表達量最高，葉片中較少。同時，該基因在生長溫度范圍內(4-40℃)均有表達，受低溫誘導，高溫脅迫抑制其表達。 4.將獲得的LeFAD3基因與含有35S啟動子的pBI121載體重組

5、，分別構建了正義和反義表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉入番茄中，通過5‰的卡那霉素篩選，獲得了轉基因番茄植株。用PCR及Northern雜交的方法對帶卡那抗性的轉基因番茄植株進一步檢測，結果證明目的基因已經(jīng)整合到部分轉基因苗的基因組中，成功地獲得了轉正義和反義LeFAD3基因的番茄植株。過量表達LeFAD3基因的轉基因植株根系與葉片膜脂中18：3含量明顯升高，而18：2含量相應降低，脂肪酸不飽和度升高。而LeFAD3基因表達發(fā)生沉默的

6、轉基因植株中18：2含量明顯增加，18：3含量相應下降，脂肪酸飽和度升高。 5.構建了原核表達載體pET-LeFAD3，并在大腸桿菌BL21中表達融合蛋白，免疫小白鼠，制備抗體，其抗血清效價為1：500。Western雜交表明，轉正義植株中LeFAD3基因已在蛋白水平過量表達。 6.轉正義基因植株比野生型具有較高的抗冷性。低溫16℃/8℃處理30天后，轉正義基因植株比野生型的生長量高。低溫(4℃)脅迫條件下處理0、3、6

7、、9、12 h后，相對電導率升高，但是野生型比轉正義基因植株增加的幅度大；低溫脅迫后，與野生型相比，由于轉正義基因植株膜脂脂肪酸不飽和程度增加，葉片的葉綠體膜和根尖細胞內的各個亞細胞器膜系統(tǒng)保持較完整，受到的損傷輕；低溫脅迫下，轉正義基因株系與野生型葉片放氧活性和Fv/Fm均下降，轉基因株系下降幅度小，4℃處理12 h后，野生型以及轉正義基因株系T1-16，T1-20和T1-6的放氧速率分別降低到原來的22.9％，32％，32.2％和3

8、8.3％。低溫脅迫12 h后，野生型，T1-16，T1-20和T1-6株系的Fv/Fm分別降低了47.6％，33.5％，29.7％和14.8％；轉正義基因番茄株系與野生型葉片和根系呼吸速率先上升后下降，其中野生型下降幅度大。這些結果表明，在低溫條件下類囊體膜18：3含量的增加對光系統(tǒng)有保護作用，能提高番茄植株的低溫抗性。 野生型和轉正義基因植株的SOD和APX活性在低溫脅迫過程中先升高后降低，低溫處理12 h后，轉正義基因植株的

9、SOD和APX活性高于野生型。野生型番茄的O2-·和H2o2的含量在低溫處理后增加，而轉正義基因植株的O2-·和H2O2含量在處理6 h后才增加，而且野生型O2-·和H2O2含量增加的程度明顯高于轉基因植株。脅迫結束時，野生型，T1-16，T1-20和T1-6的O2-·含量分別增加了53％，47％，32％和19％，而H2O2含量分別增加了79％，43％，35％和28％；MDA含量分別升高了146％，114％，100％和87％。

10、7.轉反義基因植株比野生型具有較強的耐熱性。高溫(40℃)處理下，轉反義基因植株比野生型的生長量高。40℃脅迫處理0、3、6、9、12 h后，相對電導率都升高，但是野生型比轉反義基因植株增加的幅度大；高溫處理12 h后，野生型葉綠體變圓并出現(xiàn)過氧化物體，其中有菱形的結晶物，葉片和根尖細胞內都出現(xiàn)脂滴，而轉反義基因植株仍能保持較完整的膜系統(tǒng)，損傷程度較低；轉反義基因株系與野生型葉片放氧活性和Fv/Fm均下降，其中轉基因株系下降幅度小，40

11、℃處理12 h后，野生型以及轉反義基因株系T1-10，T1-8和T1-5的放氧速率分別降低到原來的21.0％，33.5％，36.2％和45.5％。高溫脅迫12 h，野生型，T1-10，T1-8和T1-5株系的Fv/Fm分別降低了33％，28％，21％和8.9％。轉反義基因株系與野生型葉片和根系呼吸速率均下降，其中野生型株系下降幅度大。 在高溫處理過程中，野生型植株和轉反義基因植株的SOD和APX活性先升高后降低。高溫處理過程中，

12、轉反義基因植株的SOD和APX活性高于野生型。野生型植株的O2-·和H2O2的含量在高溫處理3 h后開始增加，而轉反義基因植株的O2-·和H2O2含量在處理6 h后才增加，而且野生型的O2-·和H2O2含量增加的程度明顯高于轉基因植株。脅迫結束時，野生型，T1-10，1-8和T1-5的O-·2含量分別增加了78％，68％，63％和14％，而野生型，T1-10，T1-8和T1-5的H2O2含量分別增加了70％，55.6％，48％和22.8