體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因豬.pdf

1、豬肉是人類重要的動物性食品，豬肉中所含多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）大部分為ω-6 PUFAs，而對人體健康有重要價值的ω-3 PUFAs含量較少。本研究利用體細(xì)胞核移植技術(shù)首次成功生產(chǎn)了轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因（sFat-1）克隆豬，結(jié)果如下： 實驗一：采用組織塊培養(yǎng)法，建立了7個38日胎齡的純種英系大白豬胎兒成纖維細(xì)胞系；細(xì)胞接觸抑制2d后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，80%

2、以上的細(xì)胞處于G0/G1期。 實驗二：利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將sFat-1基因轉(zhuǎn)染至大白豬胎兒成纖維細(xì)胞，并對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過大白豬胎兒成纖維細(xì)胞對G418敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，600μg/mL的G418可以在7d內(nèi)將細(xì)胞全部殺死，因此篩選時選擇該濃度較為合適。比較了脂質(zhì)體采用與DNA的比例分別為10μL：3μg、10μL：4μg、10μL：6μg和10μL：7μg時的轉(zhuǎn)染效率，其中脂質(zhì)體與DNA的比例控制在10μ

3、L：4μgm時，篩選后所得細(xì)胞克隆數(shù)最高（20個）；對篩選出的G418抗性細(xì)胞克隆中狀態(tài)較好的18個進(jìn)行了PCR及RT-PCR檢測，PCR檢測結(jié)果顯示：18、3、6、12、16及17號克隆點(diǎn)細(xì)胞，為轉(zhuǎn)基因陰性細(xì)胞；再利用RT-PCR對剩余12個PCR陽性克隆點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行RNA表達(dá)水平檢測，結(jié)果4號克隆點(diǎn)的RNA表達(dá)量極低，認(rèn)定其為轉(zhuǎn)基因陰性，其余11個為陽性。 實驗三：為了提高克隆胚胎的發(fā)育能力，將卵巢上的卵泡按直徑分為大卵泡（

4、直徑4-6 mm）及小卵泡（直徑2-3 mm）兩組，體外成熟38-42 h后作為胞質(zhì)受體，以胚胎的卵裂率和囊胚率為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，評價卵泡大小及成熟時間（卵齡）對卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響；胚胎輔助激活上，比較了胚胎輔助激活采用電激活和CHX化學(xué)激活對胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果，卵齡40 h的大卵泡卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育率（19．3±1．7%，P<0．05）顯著高于其它各組，42 h的小卵泡卵母細(xì)胞的囊胚率次之（11．0±1．3%）；CHX化學(xué)輔助激活能提

5、高胚胎的囊胚率，并且能夠顯著提高小卵泡胚胎的囊胚發(fā)育率（P<0．05），但大卵泡組胚胎囊胚率未見顯著提高。 實驗四：以鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性的細(xì)胞為核供體，體外成熟的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體構(gòu)建克隆胚胎，胚胎經(jīng)體外培養(yǎng)后進(jìn)行胚胎移植，共移植1889枚1-4細(xì)胞期克隆胚胎到10頭受體母豬的輸卵管內(nèi)，28天B超檢測9頭受體母豬妊娠（90%），7頭妊娠足月（70%）分娩產(chǎn)下21頭仔豬，體細(xì)胞克隆豬的效率為1．1%（出生仔豬/移植胚胎）。對健康存活