長鏈不飽和脂肪酸鏈延長酶與去飽和酶進化分析及phytophthora infestans中相關基因鑒定.pdf

1、作為魚油主要成分的EPA和DHA等長鏈多不飽和脂肪酸(Long-ChainPolyUnsaturated fatty acids,LCPUFAs),是胎、嬰、幼兒的視網(wǎng)膜與大腦皮層正常發(fā)育所必需的,對防治心腦血管等疾病起重要作用。它們的保健功能已得到人們廣泛認識。通常人體合成的EPA和DHA能夠滿足正常的生理活動需要,但是孕婦、嬰幼兒、老年人和疾病患者需要飲食中補充部分EPA和DHA。目前,LCPUFA主要來源于海洋野生魚和單細胞微藻。

2、由于海洋野生魚資源日益枯竭,其產(chǎn)量已不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求,而且,由于環(huán)境污染等因為導致這類魚油不適于孕婦和嬰幼兒食用,而通過單細胞微藻發(fā)酵途徑提煉魚油成本太高。因此尋找能夠持續(xù)、經(jīng)濟、安全的EPA和DHA生產(chǎn)替代來源成為亟待解決的問題。代謝基因工程技術的發(fā)展,為通過轉(zhuǎn)基因技術在油料作物中生產(chǎn)LCPUFA提供了可能。最近,已從微藻中克隆、鑒定了一些LCPUFA合成過程中的鏈延長酶和去飽和酶基因,并在油料作物中成功表達,合成了EPA和

3、DHA,但合成水平遠遠低于克隆這些基因的野生微藻。
　　 解決轉(zhuǎn)基因植物中LCPUFA合成水平低的方法除優(yōu)化基因表達、選擇合理的合成代謝途徑外,克隆超表達活性的基因顯然是最有效的途徑之一。
　　 但是,由于LCPUFA合成代謝過程中的鏈延長酶和去飽和酶,除保守區(qū)的少數(shù)幾個氨基酸高度保守外,同源性很低,造成該類新基因克隆困難。目前,主要是通過cDNA文庫雜交篩選和規(guī)模化測序相結(jié)合來篩選、克隆該類新基因,比較費時費力,成本高

4、。
　　 近年來,公共生物信息數(shù)據(jù)庫中有關各種生物的核酸、蛋白序列信息已呈爆炸式增長,為分析和鑒定某類基因提供了強大的信息資源支持。本研究擬用已知功能的LCPUFA合成代謝途徑中的鏈延長與去飽和酶氨基酸序列在NCBI上進行PSI-BLAST搜索,一方面系統(tǒng)搜索整理功能己鑒定或已預測的去飽和酶和鏈延長酶；另一方面,對搜尋到的一些未知同源序列,通過生物信息學分析手段初步篩選、鑒定可能的去飽和酶和鏈延長酶。在此基礎上,分別構(gòu)建去飽和酶

5、和鏈延長酶的進化樹,繪制這些酶基因的生物詳細分布表,為克隆、鑒定該類新基因提供全面系統(tǒng)的參考指引。
　　 生物信息學分析結(jié)果如下:
　　 1、共從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到功能已鑒定的267個去飽和酶和243個鏈延長酶,功能已預測未鑒定的107個去飽和酶和389個鏈延長酶,同時新分析預測了近400個去飽和酶和鏈延長酶類似基因。
　　 2、用neighbor-jioining法構(gòu)建了由532個去飽和酶構(gòu)成的無根進化樹,

6、進化樹共有6個骨干分枝,顯示去飽和酶在進化早期就分化為6個不同亞家族。其中4個大亞家族分別為(1)First Desaturase、(2)Omega Desaturase、(3)Front-End Desaturase和(4)Sphingolipid Desaturase,與現(xiàn)有去飽和酶分類標準相符；另外一個是在進化起源上很古老的亞家族,僅由來源于Phytophthora infestans中的3去飽和酶構(gòu)成,在進化樹中位置獨特；還有一

7、個由來源于不同生物的11個去飽和酶構(gòu)成的小亞家族,后兩個小亞家族成員不適于現(xiàn)有去飽和酶分類標準分類。
　　 3、同樣方法構(gòu)建了由871個鏈延長酶構(gòu)成的無根進化樹,進化樹共有2大支,顯示鏈延長酶在進化早期就分化為2個不同亞家族:(1)S/MUFA鏈延長酶,(2)PUFA鏈延長酶。2個亞家族間有1個共同保守的氨基酸框,意味著所有的鏈延長酶可能起源相同,不同功能的分化可能是在進化過程中適應環(huán)境變化的結(jié)果。
　　 4、對去飽和酶

8、和鏈延長酶進化樹研究分析表明,去飽和酶和鏈延長酶在功能進化上至少是通過兩個時期來完成的。第一個時期,這些蛋白分化成不同的亞家族,其中去飽和酶分化成6個亞家族,而鏈延長酶分化成2個亞家族,它們分別具有不同的底物特異性。第二個時期,每一個獨特的亞家族又發(fā)生了底物專一性和未知特異性的分化,使親緣關系很近的物種之間脂肪酸種類也出現(xiàn)了不同。即第一個時期限制了具有這些酶的功能范圍,第二個時期則是在這些范圍內(nèi)發(fā)生了不同功能的分化。
　　 5、

9、比較分析Phytophthora infestans中去飽和酶和鏈延長酶進化歷程發(fā)現(xiàn),去飽和酶在進化起源上很古老,在去飽和酶進化歷程中的第一次功能分化時期就已形成,而鏈延長酶是在進化歷程經(jīng)歷多次功能分化時期才形成的。表明來源于同一生物中同一代謝途徑中的兩種酶的進化歷程可以不同。
　　 鑒于Phytophthora infestans中EPA合成途徑中的去飽和酶在進化歷程中的獨特性,我們決定優(yōu)先對預測到的來源于Phytophtho

10、ra infestans中的3個去飽和酶和4個鏈延長酶類似基因進行克隆,并通過酵母表達系統(tǒng)進行功能鑒定。一方面是為了檢驗我們生物信息學的分析結(jié)果,另一方面是為了克隆鑒定一些超標達活性的去飽和酶和鏈延長酶基因,提高轉(zhuǎn)基因油料作物中EPA和DHA的生產(chǎn)水平,結(jié)果如下:
　　 1、RT-PCR克隆到1個長度為911bp的基因片段,序列分析表明是一個新的鏈延長酶類似基因PinE4,在釀酒酵母中的表達產(chǎn)物,可將外源底物C18:2(△9,1

11、2)脂肪酸轉(zhuǎn)變成C20:2(△11,14)脂肪酸,表明其具有△9鏈延長酶活性。
　　 2、RT-PCR克隆到1個長度1013bp的基因片段,序列分析表明是一個含有2個內(nèi)含子的新鏈延長酶類似基因PinE3,去內(nèi)含子后,獲得全長741bp的編碼片段；同樣的方法分別克隆到另外2個新的類似鏈延長酶基因PinE1(1022bp)和PinE2(1044 bp)及1個新的類似去飽和酶基因PinD1(1374bp)。
　　 本研究新預測