超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因的密碼子優(yōu)化及油脂合成相關(guān)基因的克隆.pdf

1、超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids，VLCPUFAs)，通常指含有18個(gè)碳原子以上并且?guī)в?個(gè)或2個(gè)以上的順式不飽和雙鍵的脂肪酸，比如花生四烯酸(AA，20:4△5，8，11，14)、二十碳五烯酸(EPA，20:5△5，8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6△4，7，10,13，16，19)。其中，EPA和DHA是魚油的主要有效成分，對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)和

2、健康具有重要的意義。目前，該類脂肪酸的主要來(lái)源是深海魚油。但是隨著環(huán)境污染的日益加劇以及過(guò)度捕撈造成的野生海洋魚類資源的急劇減少，魚油的產(chǎn)量和質(zhì)量都已經(jīng)不能夠滿足人們的要求。因此，尋找一條安全、穩(wěn)定、可持續(xù)的EPA/DHA替代生產(chǎn)途徑已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。眾多研究表明，利用基因工程的方法，在高等植物(特別是油料作物)中重組EPA/DHA的合成途徑進(jìn)行魚油的替代生產(chǎn)是可行的，并且取得了一定的進(jìn)展，但是EPA尤其是DHA的產(chǎn)量仍然不高，經(jīng)過(guò)分析

3、推測(cè)，造成EPA/DHA產(chǎn)量不高的原因可能是目標(biāo)植物的選擇、特異性啟動(dòng)子的選擇、酶基因的活性高低、代謝途徑的選擇、異源表達(dá)時(shí)密碼子的偏好性以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等。
　　 本研究從異源表達(dá)時(shí)密碼子的偏好性方面展開研究，對(duì)EPA/DHA合成途徑中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行多種方式的密碼子優(yōu)化，通過(guò)對(duì)優(yōu)化后酶基因的表達(dá)活性進(jìn)行分析，探索出一條密碼子優(yōu)化提高基因表達(dá)活性的最佳方案。為在植物中高效生產(chǎn)EPA/DHA奠定基礎(chǔ)。
　　 同時(shí)，我們

4、從高產(chǎn)EPA/DHA的強(qiáng)壯前溝藻(Amphidinium carterae)中對(duì)油脂合成的關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)基因進(jìn)行了克隆，為改良油料作物的油脂產(chǎn)量提供基因資源。主要結(jié)果如下：
　　 (1)球等鞭金藻(Isochrysis galbana)中△9鏈延長(zhǎng)酶基因的密碼子優(yōu)化
　　 △9鏈延長(zhǎng)酶是“△8去飽和途徑”中的關(guān)鍵酶，對(duì)于整個(gè)合成途徑具有重要意義，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有的

5、研究，結(jié)合對(duì)來(lái)源于球等鞭金藻的△9鏈延長(zhǎng)酶基因在擬南芥中表達(dá)時(shí)密碼子使用情況的分析，我們采取了兩種策略對(duì)△9鏈延長(zhǎng)酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化：第一種策略是針對(duì)偏好性最強(qiáng)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)△9鏈延長(zhǎng)酶基因中的3個(gè)編碼精氨酸的CGC密碼子(使用頻率只有20％)以不同的方式進(jìn)行優(yōu)化(單個(gè)CGC密碼子的優(yōu)化、多個(gè)CGC密碼子的優(yōu)化以及3個(gè)CGC密碼子的全部?jī)?yōu)化)，優(yōu)化成在擬南芥中高效表達(dá)的AGA密碼子，編碼氨基酸不變；第二種策略是根據(jù)N端稀有密碼子

6、的存在會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)降低的研究結(jié)果，將△9鏈延長(zhǎng)酶基因的N端16個(gè)密碼子全部?jī)?yōu)化成在擬南芥中高效表達(dá)的密碼子，編碼氨基酸不變。轉(zhuǎn)擬南芥進(jìn)行基因表達(dá)活性分析，以未優(yōu)化的△9鏈延長(zhǎng)酶基因作為對(duì)照，與對(duì)照相比，單個(gè)CGC密碼子優(yōu)化與多個(gè)CGC密碼子優(yōu)化的△9鏈延長(zhǎng)酶的表達(dá)活性變化不大，而3個(gè)CGC密碼子全優(yōu)化與N端16個(gè)密碼子全優(yōu)化的△9鏈延長(zhǎng)酶活性提高較明顯，且N端16個(gè)密碼子全優(yōu)化方案略優(yōu)于3個(gè)CGC全優(yōu)化方案。
　　 (2)馬鈴

7、薯致病疫霉(Phytophthora infestans)中△6去飽和酶基因的密碼子優(yōu)化
　　 為了驗(yàn)證△9鏈延長(zhǎng)酶優(yōu)化結(jié)果的普遍性，我們又對(duì)△6去飽和酶進(jìn)行優(yōu)化，并且在釀酒酵母中進(jìn)行鑒定?！?去飽和酶是“△6去飽和途徑”中的關(guān)鍵酶，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從馬鈴薯致病疫霉中成功克隆到了VLCPUFAs合成途徑中的多個(gè)酶基因并在釀酒酵母中進(jìn)行了功能鑒定，其中△6去飽和酶的活性很低，還不到10％。通過(guò)比較△6去飽和酶基因在馬鈴薯致病疫霉與釀酒

8、酵母中表達(dá)時(shí)密碼子的使用頻率，并在對(duì)優(yōu)化的△9鏈延長(zhǎng)酶的研究基礎(chǔ)上，我們采取了兩種策略優(yōu)化△6去飽和酶基因：第一種策略是針對(duì)偏好性最強(qiáng)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，將△6去飽和酶基因的4個(gè)CGC密碼子(使用頻率僅13％)全部?jī)?yōu)化成釀酒酵母中高效表達(dá)的AGA密碼子，編碼氨基酸不變；第二種策略是將N端16個(gè)密碼子全部?jī)?yōu)化成釀酒酵母中高效表達(dá)的密碼子，編碼氨基酸不變。轉(zhuǎn)釀酒酵母進(jìn)行表達(dá)活性分析，以未優(yōu)化的△6去飽和酶基因作對(duì)照，與對(duì)照相比，4個(gè)CGC密碼

9、子全部?jī)?yōu)化和N端16個(gè)密碼子全部?jī)?yōu)化的△6去飽和酶的活性都大大提高，無(wú)論是ω3轉(zhuǎn)化率還是ω6轉(zhuǎn)化率，都提高了30％之多，而且N端16個(gè)密碼子全優(yōu)化略優(yōu)于4個(gè)CGC密碼子全優(yōu)化的方案。這與△9鏈延長(zhǎng)酶優(yōu)化結(jié)果一致。
　　 (3)強(qiáng)壯前溝藻(Amphidinium carterae)中油脂合成關(guān)鍵酶基因的克隆
　　 我們對(duì)富含DHA的強(qiáng)壯前溝藻的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析得到了許多油脂合成關(guān)鍵酶基因的部分序列。以強(qiáng)