溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶的鑒定及其對(duì)轉(zhuǎn)基因合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的影響研究.pdf

1、長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acids,LC-PUFAs）對(duì)人體有良好生理功能，除了魚油這種傳統(tǒng)來源外，在油料作物中重構(gòu)LC-PUFAs的合成途徑是一種非常有前景的替代來源。在以表達(dá)脂連接型去飽和酶為策略的LC-PUFAs代謝工程研究中，去飽和酶中間代謝產(chǎn)物需要在PC庫(kù)和CoA庫(kù)之間進(jìn)行多次轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致LC-PUFAs合成的終產(chǎn)物含量較低。
　　LPCAT（屬于溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)

2、移酶）被推測(cè)是在轉(zhuǎn)換過程中起重要作用的?；D(zhuǎn)移酶。然而，植物來源的LPCAT報(bào)道較少，而且LPCAT對(duì)LC-PUFAs合成的影響以及參與PC和CoA庫(kù)之間脂肪?；D(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制尚不清楚。
　　本研究從煙草Nicotiana benthamiana和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum中克隆LPCAT基因，并在酵母中進(jìn)行功能驗(yàn)證和底物特異性研究。通過將LPCAT與不同類型脂肪酸去飽和酶和延長(zhǎng)酶在酵母中共表達(dá)，分析

3、其脂肪酸，CoA及脂質(zhì)組變化，試圖闡明LPCAT對(duì)LC-PUFAs合成的中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)及終產(chǎn)物積累的影響機(jī)制。主要結(jié)果如下：
　?。?）從煙草中克隆到兩個(gè)溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶基因NbLPCAT1和NbLCPAT2，其編碼產(chǎn)物均屬于MBOAT蛋白家族。LysoPAF敏感實(shí)驗(yàn)表明NbLPCAT1和NbLCPAT2都有LPCAT酰基轉(zhuǎn)移酶活性。酵母磷脂分析實(shí)驗(yàn)表明：表達(dá)NbLPCAT1和NbLPCAT2的重組酵母優(yōu)先利用16:0-LPC

4、，16:1-LPC和18:1-LPC作為酰基受體；18:2-CoA，18:3-CoA為?；w。
　　利用重組酵母微粒體為L(zhǎng)PCAT酶源的體外酶活實(shí)驗(yàn)表明：NbLPCAT1對(duì)LPC及不飽和的C18-CoAs表現(xiàn)出偏好性。NbLPCAT2對(duì)LPA表現(xiàn)出的活性比LPC要高，且對(duì)18:3-CoA有較好的偏好性。采用RT-PCR方法檢測(cè)煙草LPCAT基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明：NbLPCAT1和NbLPCAT2在花中的表達(dá)水平最高，在其它組

5、織器官中均有不同程度的表達(dá)。
　　（2）從富含EPA的三角褐指藻中克隆到一個(gè)PtLPCAT基因并驗(yàn)證功能。將NbLPCAT1,NbLPCAT2及PtLPCAT與不同來源的脂肪酸去飽和酶和延長(zhǎng)酶在酵母中共表達(dá)，這些脂肪酸去飽和酶和延長(zhǎng)酶包括：來源于三角褐指藻的脂連接型去飽和酶PtD6，PtD5；來源于小立碗蘚的脂肪酸延長(zhǎng)酶PSE；來源于青綠藻的CoA型去飽和酶OtD6和細(xì)小微胞藻中的CoA型去飽和酶MsD5。
　　構(gòu)建三種不同

6、類型重組酵母并進(jìn)行功能驗(yàn)證，三種類型的重組酵母中分別共表達(dá)：(a)CoA型去飽和酶和延長(zhǎng)酶；(b)脂連接型去飽和酶和延長(zhǎng)酶；(c)脂連接型去飽和酶、延長(zhǎng)酶和LPCAT。結(jié)果表明：(a)類型重組酵母中LC-PUFAs終產(chǎn)物的含量最高，(c)類型重組酵母與(b)類型重組酵母相比，△6去飽和酶中間代謝產(chǎn)物在CoA庫(kù)中的含量較高，終產(chǎn)物L(fēng)C-PUFAs的積累量較高，表明LPCAT的表達(dá)促進(jìn)了代謝中間產(chǎn)物的脂肪?；赑C和CoA之間的轉(zhuǎn)移，在一定

7、程度上解除脂連接型去飽和酶應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因合成LC-PUFAs過程中的代謝瓶頸，提高LC-PUFAs的積累量。
　?。?）不同類型重組酵母脂質(zhì)組分析表明：(c)類型重組酵母與(b)類型重組酵母相比，表達(dá)NbLPCAT1的重組酵母菌株中PCsn-1、sn-2位置上18:2和18:3脂?；暮棵黠@上調(diào)，表達(dá)NbLPCAT2的重組酵母菌株中PCsn-1位置18:2脂?；可险{(diào)。
　　表明LPCAT的表達(dá)能夠明顯提高△6去飽和酶反應(yīng)