棉花14-3-3蛋白在纖維發(fā)育中的功能表達(dá)和相互作用研究.pdf

1、棉花是世界上最重要的纖維作物，我國(guó)是重要的棉花生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，棉花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位。棉纖維細(xì)胞是由胚珠外表皮分化而成的不分枝單細(xì)胞毛狀突起，是棉花生產(chǎn)的主要產(chǎn)品，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接決定了棉花生產(chǎn)的產(chǎn)值和效益。因此，提高棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)一直以來都是棉花育種的主要目標(biāo)。利用基因工程的方法可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的定向轉(zhuǎn)移進(jìn)而實(shí)現(xiàn)棉花纖維產(chǎn)量與品質(zhì)的改良，因此研究棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)制、克隆與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的基因，對(duì)棉花纖維品質(zhì)

2、改良具有重要意義。
　　 14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物中高度保守的調(diào)控蛋白，它們通過識(shí)別特異的磷酸化序列與靶蛋白相互作用，參與一系列信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控過程，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。為了研究14-3-3蛋白在棉花纖維發(fā)育過程中的調(diào)控作用，我們分離克隆了棉花14-3-3基因，并對(duì)這些基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)之間的相互作用及功能進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下：
　　 1.Gh14-3-3基

3、因的分離克隆及氨基酸序列分析
　　 從棉花cDNA文庫(kù)中分離克隆了5個(gè)編碼14-3-3蛋白基因的cDNA，分別被命名為Gh14-3-3L、Gh14-3-3a、Gh14-3-3e、Gh14-3-3f、Gh14-3-3g。同時(shí)，利用PCR技術(shù)從棉花基因組中克隆了4個(gè)Gh14-3-3基因的全長(zhǎng)序列，通過與cDNA序列比較分析發(fā)現(xiàn)，Gh14-3-3L和Gh14-3-3a兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)相似，均由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成；Gh14-3-3

4、e和Gh14-3-3f兩個(gè)基因結(jié)構(gòu)相似，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，且內(nèi)含子的插入部位和大小都具有保守性。序列比較和進(jìn)化分析結(jié)果表明，這5個(gè)Gh14-3-3基因的編碼蛋白可以被分為兩類，其中3個(gè)（Gh14-3-3e、Gh14-3-3f和Gh14-3-3g）屬于非ε型14-3-3蛋白，另外2個(gè)（Gh14-3-3L和Gh14-3-3a）蛋白屬于ε型14-3-3蛋白。
　　 2.Gh14-3-3蛋白的亞細(xì)胞定位
　　 為了研

5、究Gh14-3-3蛋白在細(xì)胞中的分布情況，利用GFP熒光蛋白共定位技術(shù)研究了Gh14-3-3蛋白的亞細(xì)胞定位。構(gòu)建了Gh14-3-3L、Gh14-3-3a及Gh14-3-3e基因與eGFP的融合表達(dá)載體，并在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化棉花下胚軸。經(jīng)篩選培養(yǎng)后獲得抗性愈傷組織，激光共聚焦顯微鏡觀察表明，Gh14-3-3L蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中，Gh14-3-3a和Gh14-3-3e蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 3.Gh14-3-

6、3基因在棉纖維發(fā)育過程中高水平表達(dá)
　　 RT-PCR結(jié)果表明，5個(gè)Gh14-3-3基因都在棉花纖維中優(yōu)勢(shì)或者有較高水平的表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)水平相對(duì)較低。為了研究Gh14-3-3基因與棉花纖維起始發(fā)育階段的關(guān)系，比較了Gh14-3-3基因在無絨無絮棉和野生型棉花開花當(dāng)天胚珠中的差異表達(dá)，結(jié)果顯示有2個(gè)Gh14-3-3基因（Gh14-3-3e和Gh14-3-3f）在野生型開花當(dāng)天胚珠中的表達(dá)水平顯著高于同期無絨無絮棉胚珠中

7、的表達(dá)水平，其在野生型中的表達(dá)量分別為無絨無絮棉中的2.5倍和2.6倍；另外RT-PCR結(jié)果還表明，5個(gè)Gh14-3-3基因在棉花纖維中的表達(dá)都受到纖維發(fā)育時(shí)期的調(diào)控，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要集中在伸長(zhǎng)期的棉花纖維中，表達(dá)水平從開花后逐漸上升至開花后十天達(dá)到最高，之后逐步下降。此外，為了研究Gh14-3-3基因與影響棉花纖維發(fā)育的各種激素之間的關(guān)系，通過在胚珠離體培養(yǎng)條件下添加各種激素對(duì)纖維進(jìn)行處理并比較了Gh14-3-3基因的表達(dá)水平變化，結(jié)果

8、顯示，Gh14-3-3基因在棉花纖維中的表達(dá)水平受到生長(zhǎng)素、赤霉素、油菜素內(nèi)酯等激素水平的影響。以上結(jié)果說明，Gh14-3-3基因在棉花纖維起始、伸長(zhǎng)以及激素調(diào)控過程中可能具有重要的作用。
　　 4.Gh14-3-3蛋白之間的相互作用具有特異選擇性
　　 為了研究分離得到的5個(gè)Gh14-3-3蛋白之間能否形成同源或者異源二聚體，利用酵母雙雜交系統(tǒng)分析了5個(gè)Gh14-3-3蛋白之間的相互作用。結(jié)果顯示這5個(gè)Gh14-3-3

9、蛋白中有4組蛋白之間可以發(fā)生相互作用，然而這種相互作用都發(fā)生于不同的Gh14-3-3蛋白之間，各Gh14-3-3蛋白本身都不能形成同源二聚體。這表明Gh14-3-3蛋白相互作用具有特異性，可能以形成異源二聚體的形式作用于棉花纖維的發(fā)育過程。
　　 5.Gh14-3-3蛋白的互作蛋白篩選
　　 為了研究Gh14-3-3蛋白參與棉花纖維發(fā)育調(diào)控的機(jī)制，選擇了酵母雙雜交系統(tǒng)從棉花纖維中篩選Gh14-3-3蛋白的互作蛋白。構(gòu)建了

10、棉花纖維酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，分別依次以每個(gè)Gh14-3-3蛋白作為誘餌蛋白從棉花纖維酵母雙雜交cDNA文庫(kù)中篩選互作蛋白。通過對(duì)陽(yáng)性克隆的測(cè)序和比較分析發(fā)現(xiàn)，Gh14-3-3蛋白能夠與BZR1、MYB、H+-ATP酶等16種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。另外，我們還挑選了部分互作蛋白檢測(cè)了它們與Gh14-3-3蛋白之間互作的選擇性，發(fā)現(xiàn)多數(shù)互作蛋白都能與多個(gè)Gh14-3-3蛋白發(fā)生相互作用，并且這種相互作用是具有選擇性的。提示Gh14-3-3

11、蛋白可能在棉花纖維發(fā)育過程中的激素調(diào)控、細(xì)胞膜調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮一定的作用。
　　 6.在擬南芥中過量表達(dá)Gh14-3-3e提高植株對(duì)Brz的敏感性
　　 為了研究Gh14-3-3蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，構(gòu)建了Gh14-3-3e基因過量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)分別對(duì)Gh14-3-3e基因及其編碼蛋白的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在RNA水

12、平和蛋白水平均檢測(cè)到了Gh14-3-3e在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)。通過對(duì)過量表達(dá)純合體小苗的表型分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，在暗培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對(duì)BR合成抑制劑Brz的敏感性，說明Gh14-3-3e可能在棉花BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到調(diào)控作用。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥中BR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平的分析有待進(jìn)一步研究。
　　 7.Gh14-3-3L和Gh14-3-3e過量表達(dá)和RNAi對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的影響
　　 為了研究Gh14-

13、3-3蛋白在棉花纖維發(fā)育過程中的功能，首先將Gh14-3-3L、Gh14-3-3a和Gh14-3-3d在酵母細(xì)胞中進(jìn)行過量表達(dá)，研究Gh14-3-3基因?qū)渭?xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)方面的影響，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因的過量表達(dá)都導(dǎo)致酵母細(xì)胞出現(xiàn)顯著的縱向伸長(zhǎng)。同時(shí)，構(gòu)建了Gh14-3-3L、Gh14-3-3e基因的過量表達(dá)和RNAi載體并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化棉花，共獲得了108株轉(zhuǎn)基因植株。分析表明，過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花中Gh14-3-3基因的表達(dá)水平

14、明顯上升，大多數(shù)Gh14-3-3L和Gh14-3-3e過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花均出現(xiàn)植株矮小，節(jié)間變短，葉片成簇生長(zhǎng)以及不育等現(xiàn)象，棉鈴在開花后3-5天脫落，無法得到轉(zhuǎn)基因成熟種子和纖維。對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因棉花中的Gh14-3-3基因表達(dá)水平分析表明，在RNAi轉(zhuǎn)基因棉花中，Gh14-3-3L和Gh14-3-3e基因表達(dá)水平都受到極大程度的抑制。同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花纖維中對(duì)與纖維發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況分析結(jié)果表明，Gh14-3-3基因的沉默導(dǎo)致纖