14-3-3蛋白和Cdc25B蛋白在小鼠受精卵早期發(fā)育中作用的研究.pdf

1、本文以小鼠受精卵為研究對象，通過觀察14-3-3蛋白和Cdc25B蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況；構(gòu)建Cdc25B特異性位點(diǎn)突變表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)錄成mRNA；構(gòu)建綠色熒光蛋白與Cdc25B的融合表達(dá)載體；將mRNA、Cdc25B蛋白抗體和pEGFP-Cdc25B重組載體顯微注射入小鼠G1期受精卵，觀察PKA/Cdc25B途徑對小鼠受精卵早期發(fā)育的影響；構(gòu)建含有突變位點(diǎn)的Cdc25B特定片段的原核表達(dá)載體，在體外表達(dá)出蛋白，為體外激酶底物磷酸

2、化反應(yīng)提供了基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)材料：中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供昆明系雌、雄性小白鼠；pBSK-Cdc25B由TonyHunter教授(The Salk Institute)惠贈；pEGFP-C3載體由復(fù)旦大學(xué)劉喻博士惠贈；克隆載體pGEM-T Easy vector購于Promega公司；表達(dá)載體pBluescript Ⅱ/SK購于Stratagene公司；感受態(tài)E.coli JM109菌株購于寶生物有限公司；mMESSAGE mMA

3、CHINE體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Ambion公司；QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit快速定點(diǎn)突變試劑盒購于Stratagene公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒購于Qiagen公司；cdc2磷酸酪氨酸pTyr15抗體、14-3-3蛋白抗體、Cdc25B蛋白抗體購于Santa Cruz公司；小鼠Cdc258321位絲氨酸磷酸化抗體由Proteimech Group公司合成；限制性內(nèi)切酶XhoI、BamH

4、I、XbaI購于MBI公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；M2和M16培養(yǎng)液、Hoechst 33258和其它試劑購于Sigma公司。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、小鼠超排卵及受精卵的采集和培養(yǎng)。取3-5周成熟雌性昆明系小鼠，腹腔內(nèi)注射PMSG 10IU/只，46-48h后腹腔注射hCG10IU/只。當(dāng)日將注射hCG后的雌鼠與成熟雄性小鼠合籠過夜。次日清晨檢查雌鼠陰栓，有

5、陰栓者視為交配成功，將其脫頸椎處死，取輸卵管壺腹部，在實(shí)體顯微鏡下撕開壺腹部末端，讓受精卵細(xì)胞團(tuán)流出，透明質(zhì)酸酶除顆粒細(xì)胞，用M2培養(yǎng)液洗受精卵，直至卵周無顆粒細(xì)胞。需要培養(yǎng)的受精卵移入M16培養(yǎng)液中，覆蓋礦物油，在37℃、5％CO<,2>，飽和濕度的CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 2、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)。將各期受精卵放入2％多聚甲醛溶液固定30分鐘，0.1％Triton x-100固定10min，PBS(含5％BSA)封閉40min

6、。加入14-3-3抗體和Cdc25B抗體4℃過夜。次日加入FITC標(biāo)記的IgG和TRITC標(biāo)記的IgG 37℃ 1h。Hoechst 33258熒光染料37℃染色30分鐘，使核酸著色，在熒光顯微鏡下分別觀察14-3-3及Cdc25B蛋白在受精卵中的定位及核酸染色情況。 3、Cdc25B各種突變體的構(gòu)建。以pBSK-Cdc25B-WT和pBSK-Cdc25B-S321A為模板，應(yīng)用特異性引物，將Cdc25B 229位絲氨酸突變成丙

7、氨酸，構(gòu)建成pBSK-Cdc25B-S229A和DBSK-Cdc25B-S229A/S321A突變體表達(dá)載體，經(jīng)DNA序列測定確定為成功引入突變。 4、綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體的構(gòu)建。限制性內(nèi)切酶XhoI和BamHI將pBSK-Cdc25B-S229A/S321A、pBSK-Cdc25B-S321A、pBSK-Cdc25B-S229A、pBSK-Cdc25B-WT和pEGFP-C3載體雙酶切后，利用T4DNA連接酶連接后構(gòu)建成綠

8、色熒光蛋白融合表達(dá)載體pEGFP-Cdc25B-S229A/S321A、pEGFP-Cdc25B-S321A、pEGFP-Cdc25B-S229A和pEGFP-Cdc25BS-WT。 5、體外轉(zhuǎn)錄： 各種重組體取1μg，經(jīng)XbaI酶切線性化，應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將制備好的線性模板體外轉(zhuǎn)錄成帶帽mRNA，加入1μlDNase I，在37℃反應(yīng)15min以消化DNA模板。用酚、氯仿抽提純化mRNA，最后加入氯化鋰沉淀mRNA，

9、按需要濃度將mRNA溶于EDTA中。 6、顯微注射： 顯微注射應(yīng)用EppendorfTrasferman顯微操作系統(tǒng)，OlympuslX-70倒置顯微鏡，DIC調(diào)制相差觀察。分別將各種mRNA、質(zhì)粒、抗體注射到受精卵的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。注射體積約10pl。設(shè)置TE緩沖液注射組和非注射組作為對照組。在hCG后25-35小時(shí)之間觀察受精卵形態(tài)和卵裂率，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、受精卵14-3-3蛋

10、白和Cdc25B蛋白的表達(dá)與定位。小鼠1-細(xì)胞期胚胎14-3-3蛋白為同一種亞型，而且各期受精卵中14-3-3蛋白的表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)。在G1和S期Cdc25B蛋白被磷酸化，蛋白條帶位于83kDa左右；G2期和M期蛋白去磷酸化，蛋白條帶位于65kDa左右。G1期Cdc25B蛋白表達(dá)量很少，S期開始增加，G2期達(dá)到最大(對比于G1、S、M期表達(dá)水平有顯著性差異，P<0.05)，M期又開始減少。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，綠色熒光標(biāo)

11、記的14-3-3蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。紅色熒光標(biāo)記的Cdc25B蛋白在G1期位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，S和G2期主要位于細(xì)胞質(zhì)皮質(zhì)部分，M期位于整個細(xì)胞。14-3-3蛋白和Cdc25B蛋白在G1期共定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在S期和G2期共定位于細(xì)胞質(zhì)皮質(zhì)部分，M期共定位于整個細(xì)胞(呈黃色熒光)。在M期受精卵中可看到綠色熒光蛋白標(biāo)記的Cdc25B部分從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核區(qū)及其周圍。 2、小鼠受精卵不同時(shí)期Cdc2-Tyr15的磷酸化

12、狀態(tài)檢測。收集G1、S、G2和M期受精卵，檢測Cdc2-Tyr15的磷酸化狀態(tài)。G1期和S期可檢測到很強(qiáng)的Cde2-Tyr15的磷酸化信號；在G2期Cdc2-Tyr15的磷酸化信號很弱；而M期未發(fā)現(xiàn)任何Cdc2-Tyr15的磷酸化信號。 3、Cdc25B野生型及各種突變體mRNA顯微注射對小鼠受精卵卵裂率的影響及cdc2-Tyr15磷酸化狀態(tài)的檢測。為了觀察Cdc25B蛋白對小鼠受精卵發(fā)育的作用，我們構(gòu)建了不同的Cdc25B蛋白

13、突變體，轉(zhuǎn)錄成mRNA，顯微注射Nd,鼠受精卵中。結(jié)果顯示Cdc25B-S229A/S321A組在hCG后26.5小時(shí)開始卵裂，卵裂率為90％；Cdc25B-S321A組在hCG后27小時(shí)開始出現(xiàn)卵裂，卵裂率為80.2％；Cdc25B-S229A組在hCG后27.5小時(shí)開始出現(xiàn)卵裂，卵裂率為75.2％；Cdc25B-WT 在hCG后28小時(shí)開始出現(xiàn)卵裂，卵裂率為75.5％。檢測Cdc2.Tyr15的磷酸化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)正常對照組在hCG后26

14、.5小時(shí)Cdc2-Tyr15處于磷酸化狀態(tài)，28不時(shí)檢測到極微弱的磷酸化，證明MPF開始激活；Cdc25B-S229A/S321A組、Cdc25B-S321A組、Cdc25B-S229A組、Cdc25B-WT組分別在264,時(shí)、27小時(shí)、27.5小時(shí)、28小時(shí)幾乎檢測不到Cdc2-Tyr15的磷酸化，證明MPF已經(jīng)激活。 4、Cdc25B抗體顯微注射對小鼠受精卵卵裂率的影響。對照組在hCG后28.5小時(shí)開始出現(xiàn)卵裂，至31小時(shí)已

15、分裂成2-細(xì)胞期胚胎，卵裂率約61％左右，對照組組間卵裂率無顯著性差異(P>0.05)；在小鼠受精卵G1期注射Cdc25B抗體，hCG后28.54,時(shí)仍處于1-細(xì)胞期，hCG后32小時(shí)開始卵裂，hCG后35小時(shí)只有10.9％的受精卵到達(dá)2-細(xì)胞期，與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)。 5、小鼠受精卵Cdc25B蛋白321位絲氨酸磷酸化狀態(tài)的檢測。分別收集1-細(xì)胞期胚胎的G1、S、G2、M期受精卵，應(yīng)用Cdc258321位絲

16、氨酸特異性磷酸化抗體檢測各時(shí)期Cdc258321位絲氨酸的磷酸化狀態(tài)。在G1和S期檢測到磷酸化的Cdc25B，而G2和M期沒有檢測到任何Cdc258321 氨酸磷酸化信號，說明在G1和S期Cdc258321位絲氨酸被磷酸化，在G2和M期去磷酸化。 研究結(jié)論： 1、Cdc25B蛋白可以在不同時(shí)期的小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間進(jìn)行穿梭，Cdc25B的核輸出對于啟動受精卵的有絲分裂是必須的。14-3-3蛋白可以通過調(diào)節(jié)Cdc2