轉(zhuǎn)錄因子Tbx18在小鼠胚胎心臟發(fā)育中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、T-box基因家族為脊椎動(dòng)物心臟的正常發(fā)育所必須，對(duì)早期心臟譜系的確定有重要作用，并參與腔室、血管的分化及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成。轉(zhuǎn)錄因子Tbx18是T-box家族的新成員，是新的祖細(xì)胞標(biāo)記因子之一，具有誘導(dǎo)多向分化潛能，研究認(rèn)為其主要負(fù)責(zé)心管后極的延伸，它標(biāo)記的心臟祖細(xì)胞被稱(chēng)為第三心臟發(fā)育區(qū)心臟祖細(xì)胞，對(duì)心臟的發(fā)育起重要作用。因此，明確轉(zhuǎn)錄因子Tbx18胚胎在心臟發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空定位、定量表達(dá)及其對(duì)心臟發(fā)育的作用，對(duì)進(jìn)一步的功能研究具有重

2、要意義。
　　目的：檢測(cè)Tbx18在小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空定位定量表達(dá)模式；揭示Tbx18在小鼠胚胎發(fā)育中的作用。
　　方法：利用地高辛標(biāo)記試劑盒標(biāo)記并合成Tbx18 RNA探針，用原位雜交技術(shù)檢測(cè)小鼠整體胚胎及整體心臟Tbx18 mRNA的表達(dá)，并對(duì)雜交后的結(jié)果進(jìn)行切片分析。用熒光定量PCR檢測(cè)小鼠胚胎期心臟mRNA的定量表達(dá)。用X-gal染色檢測(cè)Tbx18-Cre/Rosa26R/LacZ基因譜系示蹤模型小鼠的報(bào)告基因

3、LacZ蛋白的表達(dá)。用體視鏡觀(guān)察Tbx18Cre/Cre基因敲除模型小鼠胚胎的發(fā)育狀況并用HE染色來(lái)觀(guān)察該模型胚胎心臟發(fā)育受到的影響。
　　結(jié)果：1.原位雜交結(jié)果顯示：小鼠胚胎轉(zhuǎn)錄因子Tbx18 mRNA在E9.5d主要在小鼠胚胎的前體心外膜表達(dá)；在E10.5d在小鼠胚胎的前體心外膜及心外膜均有表達(dá)；在E11.5d前體心外膜無(wú)表達(dá)，而在心外膜的表達(dá)增多；12.5d在小鼠胚胎期的心外膜明顯表達(dá)，并逐漸定位于心內(nèi)膜下的心肌細(xì)胞；大于E

4、12.5d向心肌細(xì)胞分化表達(dá)的量逐漸增多。在E12.5d至E16.5天mRNA的表達(dá)量逐漸增加，之后表達(dá)量逐漸下降，至出生時(shí)明顯減少。
　　2.熒光定量PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)錄因子Tbx18在E12.5d至E16.5d的胚胎表達(dá)量逐漸增多，大于E16.5d的胚胎表達(dá)量逐漸減少，出生時(shí)表達(dá)明顯減少。
　　3.X-gal染色顯示：Tbx18-Cre/Rosa26R/LacZ雙雜基因譜系示蹤模型在早期小鼠胚胎期心臟LacZ蛋白在在。E

5、9.5d主要位于胚胎心臟前體心外膜；E10.5d以后逐漸分化形成心外膜；E11.5主要在心外膜表達(dá)；而在大于E12.5d逐漸在心室、心房及竇角區(qū)等心臟組織中表達(dá)。
　　4.用體視鏡觀(guān)察到Tbx18Cre/Cre基因敲出小鼠胚胎整體長(zhǎng)度變短，全身水腫。HE染色顯示Tbx18Cre/Cre基因敲出小鼠心臟發(fā)育異常，表現(xiàn)為竇角區(qū)心肌化延遲和竇房結(jié)頭部缺失等發(fā)育異常。
　　結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子Tbx18是小鼠胚胎期心臟前體心外膜祖細(xì)胞群的

6、標(biāo)志之一，其表達(dá)具有時(shí)空特異性，表現(xiàn)為由前體心外膜向心外膜逐漸遷移，并逐漸向心肌細(xì)胞分化，其在心臟的表達(dá)有逐漸增加又逐漸降低的過(guò)程；Tbx18-Cre/Rosa26R/LacZ基因譜系示蹤模型小鼠揭示出Tbx18在胚胎早期由前體心外膜向心外膜遷移，并在胚胎中晚期參與分化形成心房、心室及竇角區(qū)的心肌組織，說(shuō)明其對(duì)心臟的發(fā)育起重要作用；Tbx18Cre/Cre敲出模型小鼠在胚胎整體及胚胎心臟的發(fā)育都表現(xiàn)出現(xiàn)明顯的異常，尤其是竇角區(qū)心肌化的延