GhPRP5基因在棉纖維發(fā)育中的功能研究.pdf

1、棉花(Gossypium hirsutum)是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，是纖維紡織品的主要原材料。棉纖維屬于單細(xì)胞，是由棉花胚珠的外珠被表皮層的單細(xì)胞分化和發(fā)育而來的，其分化和發(fā)育的過程可以分為四個重疊的時期：纖維細(xì)胞的起始、伸長或初生細(xì)胞壁的加厚、次生壁的加厚以及棉纖維的脫水成熟。棉花的生長發(fā)育過程受到環(huán)境中多種生物和非生物脅迫因子的影響，造成棉花產(chǎn)量大幅度降低。因此研究棉纖維發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控和功能，對于改善棉纖維的品質(zhì)和提高

2、其產(chǎn)量具有重要意義。
　　 在先前的研究中，本實驗室從棉花cDNA文庫中分離鑒定了5個編碼富含脯氨酸的蛋白質(zhì)基因。其中GhPRP5 cDNA包含546 bp的開放閱讀框，編碼的蛋白質(zhì)含有182個氨基酸，該蛋白質(zhì)富含Pro(13.2％)、Lys(13.7％)、Glu(8.8％)。Real-time RT-PCR和Northern blotting分析表明GhPRP5在棉纖維中特異表達(dá)，并受棉纖維發(fā)育階段調(diào)節(jié)，在5 dpa纖維中表達(dá)

3、量最高。GhPRP5的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，GhPRP5主要定位在細(xì)胞膜上。本文進(jìn)一步對GhPRP5的表達(dá)和功能進(jìn)行了研究，取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.GhPRP5啟動子是纖維特異性的
　　 棉纖維特異的啟動子可用于驅(qū)動基因在棉纖維中表達(dá)而用于纖維品質(zhì)改良。我們通過Genome walking的方法分離得到了長度為2217 bp的GhPRP5啟動子，利用PlantCARE軟件分析，發(fā)現(xiàn)了大量激素和脅迫應(yīng)答元件。構(gòu)建

4、了GhPRP5啟動子：GUS的融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入到擬南芥和煙草中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。GUS活性分析表明，在轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座葉的表皮毛中可以特異性地檢測到GUS活性。同樣地，在轉(zhuǎn)基因煙草葉片、葉柄以及莖的表皮毛中也可以檢測到很強(qiáng)的GUS活性。由于棉纖維與擬南芥和煙草的表皮毛在結(jié)構(gòu)和遺傳上具有相似性，表明GhPRP5的啟動子是纖維特異性的。
　　 2.過量表達(dá)GhPRP5抑制轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的生長發(fā)育
　　

5、 為研究GhPRP5在植物中發(fā)揮的功能，我們構(gòu)建了GhPRP5的過量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化了擬南芥，共獲得8個株系的T3代純合體，在8個不同的轉(zhuǎn)基因株系中，GhPRP5顯示了不同程度的表達(dá)，其中在L7-2和L11-1中表達(dá)水平最高，因此我們選擇這兩個株系進(jìn)行表型分析。在正常培養(yǎng)條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)未見差異，而在幼苗生長期，與野生型相比，GhPRP5過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥具有葉片變小，主根顯著變短等表型。對每1，000粒擬南芥種

6、子重量統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)表明，L7-2和L11-1的種子每1，000粒的重量分別只有野生型1，000粒重量的70％和60％左右。進(jìn)一步通過比較5周野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥第10片蓮座葉內(nèi)表皮細(xì)胞的大小和數(shù)目，以及18天野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥第6片真葉細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)GhPRP5的轉(zhuǎn)基因擬南芥L7-2和L11-1具有變小的表型是由于細(xì)胞變小了，而細(xì)胞數(shù)目未發(fā)生變化。表明在擬南芥中過量表達(dá)GhPRP5抑制了擬南芥細(xì)胞的生長和膨脹，但不影

7、響細(xì)胞分裂。
　　 3.抑制GhPRP5基因表達(dá)促進(jìn)棉纖維細(xì)胞伸長
　　 為研究GhPRP5在纖維發(fā)育中的功能，構(gòu)建了GhPRP5的RNAi載體，轉(zhuǎn)化棉花，一共獲得T0代12個株系的轉(zhuǎn)基因棉花，對轉(zhuǎn)基因棉花基因組DNA的PCR檢測發(fā)現(xiàn)大約有80％是陽性苗。提取T2代6個株系陽性苗的5 dpa纖維RNA，利用Real-time RT-PCR分析GhPRP5在野生型及GhPRP5-RNAi轉(zhuǎn)基因棉花中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GhPR

8、P5基因在所有檢測的轉(zhuǎn)基因棉花中的表達(dá)均只有野生型的10％-40％，我們選擇具有代表性的3個株系L1、L4和L8進(jìn)行表型分析，通過對80多個棉鈴的棉纖維長度的統(tǒng)計結(jié)果表明，與野生型相比較，T2代的GhPRP5-RNAi棉纖維長度增加，而且非常有意思的是，轉(zhuǎn)基因棉花的短絨也變長了。
　　 4.棉纖維發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析
　　 細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)統(tǒng)一體對協(xié)調(diào)植物細(xì)胞生長和膨脹非常重要，我們研究了一些與纖維發(fā)育相關(guān)的

9、參與細(xì)胞壁合成，細(xì)胞骨架合成的基因在T2代GhPRP5-RNAi轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：GhACT1在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)沒有明顯的變化，GhTUA9在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)不同程度的上調(diào)了20-74％，而GhTUB1在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)顯著降低了(將近50％)。GhFLA2在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平大約只有野生型的38-82％，GhFLA14在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平下調(diào)了近80％，而與野生型相比較，GhFLA4在轉(zhuǎn)基因株系中

10、的表達(dá)顯著上調(diào)了近2倍，GhFLA15在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)顯著上調(diào)了近10倍。除此之外，與野生型相比較，纖維特異性基因GhPRP3在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)也升高了約2-3倍。細(xì)胞膨脹素基因GhEXP在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平大約是野生型中表達(dá)水平的2倍。GhXET在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)也顯著的增加了近3倍。這些結(jié)果表明，抑制GhPRP5的表達(dá)影響了參與細(xì)胞骨架類、AGPs、PRPs、膨脹素以及XTH合成相關(guān)基因的表達(dá)，說明細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架

11、連續(xù)統(tǒng)一體在纖維發(fā)育過程中起著非常關(guān)鍵的作用。
　　 5.酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與GhPRP5相互作用的蛋白
　　 為研究可能與GhPRP5相互作用的蛋白，我們以GhPRP5為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，篩查了10 dpa纖維cDNA文庫。通過比較分析發(fā)現(xiàn)，所鑒定的8個蛋白可以分為4類，其中5個都是未知蛋白，另外3個是N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，生長素應(yīng)答家族蛋白和GhPRP5。并對這3個感興趣的蛋白進(jìn)行了小量Mating回轉(zhuǎn)

12、驗證相互作用實驗，結(jié)果表明這3個蛋白均能夠與GhPRP5相互作用。這就表明在棉纖維細(xì)胞中可能形成了GhPRP5同源二聚體。
　　 6.過量表達(dá)GhPRP5增強(qiáng)了擬南芥對鹽和ABA的敏感性
　　 越來越多的實驗證據(jù)顯示富含脯氨酸的蛋白質(zhì)參與應(yīng)答生物和非生物脅迫。本文也研究了鹽和ABA處理對過量表達(dá)GhPRP5的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)以及幼苗生長的影響。在種子萌發(fā)階段，鹽脅迫和ABA處理顯著抑制了轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的萌發(fā)。在幼苗