鯉腦組織低溫差異表達候選基因的篩選、cDNA全長克隆及功能預測.pdf

1、為從基因表達水平上研究魚類耐低溫機制，選取東北地區(qū)具有耐低溫性狀的黑龍江鯉(Cyprinuscarpio)為實驗材料，采用雙標準曲線相對實時熒光定量PCR法進行基因表達量差異檢測。鑒于在溫度發(fā)生變化的過程中，腦部是神經中樞，同時也是參與體溫調節(jié)的重要組織，其中的基因表達變化通常是最快、最靈敏的。通過查閱文獻，收集并下載前人報道的鯉腦組織在低溫下誘導表達的EST序列50個，根據(jù)熒光定量RT-PCR的擴增特點和要求，設計50個候選基因的引物

2、使其擴增片段大小在100～200bp之間。將黑龍江野鯉分別設23℃常溫對照組和6℃低溫待測組，采集鯉腦組織提取RNA并反轉錄成cDNA。隨機挑選2個模板用普通PCR法對50對引物進行篩選，結果有26個候選基因及內參基因的引物擴增條帶清晰、唯一。使用Rotorgene3000定量PCR儀，采用雙標準曲線法，分別以23℃常溫對照組和6℃低溫待測組的黑龍江鯉腦組織cDNA為模板，以18SrRNA為內參基因，檢測26個候選基因的相對表達量。實驗

3、數(shù)據(jù)經顯著性分析發(fā)現(xiàn)，有5個候選基因在低溫條件下表達量顯著上升(P<0.01)，與對照組相比它們的表達量分別上升了2.11倍、13.9倍、2.52倍、7.38倍和1.83倍，基因功能比對結果表明其編碼蛋白產物分別是脂肪酸鏈延伸酶(ELO)，?；o酶A脫氫酶(SCD)，轉錄起始因子ⅡB(TFⅡB)，肌醇-1-磷酸合成酶(MIPS：EC5.5.1.4)，血腦屏障HT7抗原(basigin)；有7個候選基因在低溫下表達量分別下降了21.8％、

4、25.9％、16.6％、23.7％、15.8％、16.3％、42.5％，但對照組和待測組差異不顯著(P>0.05)，基因功能比對發(fā)現(xiàn)它們主要參與抑制糖酵解，促進細胞凋亡和干擾神經系統(tǒng)的重塑活動。
　　 將鯉魚5個候選基因的序列在NCBI斑馬魚數(shù)據(jù)庫中進行blast同源比對，發(fā)現(xiàn)其中4個候選基因均與斑馬魚(Daniorerio)同源，仍以18SrRNA為內參基因，檢測上述4個候選基因在斑馬魚腦組織中的表達差異。結果表明低溫條件下脂

5、肪酸鏈延伸酶、酰基輔酶A脫氫酶、轉錄起始因子ⅡB、血腦屏障HT7抗原4個基因的表達量分別是常溫對照組的0.76倍，1.62倍，1.36倍和1.05倍，表達量差異不顯著(P>0.05)。鯉魚及斑馬魚定量結果充分說明上述5個基因很有可能與魚類耐低溫性狀密切相關，根據(jù)其各自參與的機體代謝功能推測，低溫條件誘導鯉魚某些基因的表達，通過加強不飽和脂肪酸代謝活動，神經系統(tǒng)調節(jié)作用，細胞轉錄活動及腦部細胞內外的物質運輸及交換作用，以達到對冷環(huán)境的適應

6、。
　　 5個鯉腦組織低溫差異表達候選基因的獲得為進行不耐低溫魚類的基因工程育種提供了基因元件。使用Clontech的SMARTerTMRACEcDNA擴增試劑盒分別擴增5個候選基因的5’及3’端cDNA序列，測序后利用DNAstar-SeqMan程序拼接出重疊群(contig)序列，去除通用引物序列后得到每個基因的全長cDNA序列，并向NCBI提交序列信息，獲取登錄號分別為JF836160、JF836162、JF836163、

7、JF836164、JF836165，cDNA全長分別為2737bp、2618bp、1555bp、2154bp、1971bp。利用NCBIORFfinder軟件尋找5個基因的開放性讀碼框(ORF)，讀碼框長度分別為876bp，975bp，951bp，1659bp，840bp。用DNAstarEditseq軟件將每個基因的最長正義鏈相位點ORF翻譯成蛋白質序列，5個基因編碼的蛋白質序列長度分別為291aa，324aa，316aa，552aa

8、及279aa。使用protparam、protscale、TMHMM、PHD、InterProScan、SWISS-MODEL等軟件預測5蛋白質理化性質、二級結構及高級結構。結構域預測結果表明5個蛋白質的功能分別為脂肪酸鏈延伸酶、脂肪酸脫氫酶、轉錄起始因子ⅡB、肌醇-1-磷酸合成酶及Basigin蛋白；蛋白質同源建模結果表明轉錄起始因子ⅡB及肌醇-1-磷酸的合成酶的同源蛋白三維結構已經有所研究，但對于脂肪酸延伸酶、脂肪酸脫氫酶及Basi

9、gin蛋白的三維結構還知之甚少。根據(jù)各自的氨基酸序列Blastp結果，運用MEGA4.0軟件構建分子進化樹，分子進化樹結果表明，鯉魚蛋白質進化距離與屬冷水魚類的大西洋鮭(salmosalar)及屬溫水性魚類的草魚(Ctenopharyngodonjdellus)最近，而與屬熱帶魚類的斑馬魚、遮目魚(Chanoschanos)稍遠，說明這些蛋白功能與魚類的溫度適應性緊密相關。
　　 為準備后續(xù)轉基因實驗，選取Tol2轉座子載體作為