新基因HA117全長cDNA克隆及其耐藥功能的實驗研究.pdf

1、目的: 應用組織芯片結合原位雜交的方法篩選出HA117基因組織表達譜。然后以組織表達譜篩選出的高表達HA117基因的腎臟組織為模板，通過RACE的方法克隆基因全長cDNA，進一步應用重組腺病毒介導的方法獲得高表達HA117基因的K562、Jurkat細胞，初步研究HA117基因對K562、Jurkat細胞的多藥耐藥（MDR）功能。 方法: 1.組織表達譜篩選，選取石蠟包埋的31例常見腫瘤組織標本制和17例癌旁正常

2、組織制作組織芯片，應用mRNA原位雜交技術檢測HA117mRNA在組織芯片各種組織中的表達情況； 2.組織表達譜結果提示腎臟組織高表達HA117基因，收集并提取腎臟組織總mRNA，首先應用RT-PCR方法驗證HA117基因在腎臟組織表達情況；然后在高表達HA117基因腎臟組織中，根據已獲得的已知HA117基因序列為模板設計特異引物，通過RACE技術克隆HA117基因全長cDNA序列； 3.構建攜帶新基因HA117全長cD

3、NA序列的重組腺病毒，酶切質粒載體pAdTrack-CMV和目的基因HA117后，用T4DNA連接酶將載體和目的基因定向克隆連接，然后篩選和鑒定含目的基因HA117的重組質粒pAdTrack-HA117。將篩選正確的質粒pAdTrack-HA117導入已制備的腺病毒同源骨架質粒BJ-Adeasy中，產生腺病毒質粒Adeasy-HA117，進一步酶切鑒定得到的重組腺病毒質粒Adeasy-HA117。脂質體介導的方法將Adeasy-HA11

4、7轉染入產病毒包裝細胞HEK293，通過乒乓感染，收獲高滴度Ad5-HA117重組腺病毒；并用RT-PCR方法驗證，HA117基因在重組腺并毒Ad5-HA117感染的HEK293細胞的表達情況； 4.重組腺病毒Ad5-HA117體外感染K562、Jurkat細胞，將重組腺病毒Ad5-HA117體外感染K562、Jurkat細胞，應用流式細胞術及RT-PCR方法檢測感染后的K562細胞HA117表達情況； 5.檢測感染重組

5、腺病毒Ad5-HA117使HA117基因高表達后白血病細胞耐藥性改變：實驗分四組：K562細胞組，K562/Ad5-HA117細胞組，K562/ Ad5-GFP細胞組，K562/ Ad5-mdrl細胞組，Jurkat細胞分組同K562。通過對細胞活性、細胞形態(tài)學及MTT法抗癌藥物敏感實驗，柔紅霉素排泄實驗等檢測HA117基因高表達前后細胞形態(tài)及耐藥性的變化，初步研究HA117基因的耐藥功能及耐藥機制。 結果: 1.新基因

6、HA117 mRNA在人體癌旁正常組織和良性腫瘤、惡性腫瘤組織中均有表達，惡性腫瘤組織中表達陽性率高于良性腫瘤及癌旁正常組織中表達陽性率（P>0.5）。在鱗癌和腺癌中的陽性表達率分別是16.67％和61.54％，腺癌中的表達高于鱗癌（P<0.05）。有轉移的癌組織中HA117 mRNA的表達率高達70％，明顯高于非轉移型腫瘤組織的20％（P<0.05）； 2.首先采用RT-PCR方法驗證了HA117基因在腎臟組織中高表達。HA1

7、17基因的3'RACE PCR產物大小在400bp左右，5'以RACE PCR產物大小在950bp左右，將HA117基因3'RACE序列、5'RACE擴增序列與已知的HA117基因序列拼接后，得到1110 bp的全長cDNA序列； 3.經酶切鑒定成功構建腺病毒重組質粒Ad5-HA117，重組腺病毒Ad5-HA117成功轉染包裝細胞，在細胞內得到良好的表達，并在包裝細胞中迅速擴增，獲得高滴度的重組腺病毒。收獲的病毒感染液滴度達1.

8、5×1011pfu/ml；RT-PCR方法證實外源性HA117基因在感染HEK293細胞基因組中功能性表達； 4.重組腺病毒Ad5-HA117成功將外源性HA117基因導入K562、Jurkat細胞，轉染48小時后發(fā)現(xiàn)隨著感染復數(shù)的增加，病毒對K562、Jurkat細胞的感染率也增加，MOI值為100時細胞的存活率和感染率均較好，轉染率分別可以達到39.72％、17.10％；RT-PCR方法證實外源性HA117基因在轉染K562

9、、Jurkat細胞基因組中功能性表達； 5.轉染HA117基因的K562、Jurkat細胞對VCR、AD5M、Vp-16、DNR、MMC、CTX藥物的耐藥性均比低表達HA117基因未轉染的k562、Jurkat細胞增高，分別增高2～7倍（P<0.05或0.01），轉染空載體組細胞耐藥性跟未轉染組的k562、Jurkat細胞相比無顯著差異（P>0.05）；感染Ad5-HA117組細胞與感染Ad5-mdrl組相比，耐藥性無顯著差異（

10、P>0.05）。轉染HA117基因的使其高表達后的K562、Jurkat細胞，與轉染了MDR1基因的細胞組柔紅霉素排除實驗結果顯示，感染Ad5-HA117組細胞未見有明顯的藥物外排泵功能。 結論: 1.初步證實HA117基因，在人體癌旁正常組織和良性腫瘤、惡性腫瘤組織中均有表達，惡性腫瘤組織中表達陽性率高于良性腫瘤及癌旁正常組織中表達陽性率。HA117表達陽性率可能與惡性腫瘤的組織學類型及是否為轉移瘤有關； 2.

11、腎臟組織中高表達HA117基因，采用RACE法從腎臟組織中成功克隆得到了HA117基因全長cDNA序列，為全長1110bp； 3.應用分子生物學方法構建了HA117重組腺病毒Ad5-HA117。通過熒光顯微鏡證實，重組腺病毒Ad5-HA117成功轉染包裝細胞，在細胞內得到良好的表達，獲得高滴度的重組腺病毒。證實外源性HA117基因在感染的HEK293細胞有效表達； 4.通過腺病毒載體可在體外將外源性HA117基因有效的轉