細(xì)胞增殖分化過程中的實(shí)時(shí)分子成像研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞大多體現(xiàn)出異常增殖的細(xì)胞學(xué)行為。此外，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells(CSCs))對(duì)腫瘤惡性進(jìn)展的不良影響已被證實(shí)。CSCs的數(shù)量稀少，但其增殖、分化等細(xì)胞生物學(xué)行為對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要的影響。能量代謝是細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。不同表型的細(xì)胞可能具有不同的能量代謝狀態(tài)。研究表明，CSCs的代謝方式異于其分化的后代。對(duì)于腫瘤細(xì)胞尤其是CSCs來說，其代謝方式可隨所處微環(huán)境因素變化而發(fā)生轉(zhuǎn)變。不僅如此，腫瘤所處的微

2、環(huán)境也極大地影響著細(xì)胞的各種生物學(xué)行為。動(dòng)態(tài)研究微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的各種生物學(xué)動(dòng)態(tài)變化的影響有著極為重要的意義。
　　微流控芯片在模擬腫瘤微環(huán)境用于細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-細(xì)胞微環(huán)境相互作用的研究中富有廣闊前景。此外，細(xì)胞的個(gè)體差異性往往表現(xiàn)為對(duì)同一刺激的響應(yīng)程度、時(shí)間的差異，而熒光成像具有靈敏度高，實(shí)時(shí)分析的特點(diǎn)，因此適用于單細(xì)胞水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析。熒光實(shí)時(shí)成像結(jié)合微流控芯片腫瘤細(xì)胞模型用于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究，對(duì)于獲取細(xì)胞轉(zhuǎn)化、運(yùn)動(dòng)過程中特

3、定分子的變化信息極具優(yōu)勢(shì)。
　　本論文以研究腫瘤細(xì)胞的增殖、分化中的重要轉(zhuǎn)變過程為出發(fā)點(diǎn)，發(fā)展實(shí)時(shí)熒光成像的方法，動(dòng)態(tài)追蹤重要轉(zhuǎn)變過程中的特定分子變化，并建立微流控細(xì)胞微環(huán)境模型，研究微環(huán)境因素變化對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。主要開展了以下工作:
　　首先基于微流控芯片，綜述了細(xì)胞生物學(xué)的體外研究相關(guān)進(jìn)展，利用微流控芯片易于操控模擬體內(nèi)微環(huán)境的特點(diǎn)，結(jié)合熒光實(shí)時(shí)成像高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)針對(duì)腫瘤增殖、腫瘤干細(xì)胞分化相關(guān)的熒光實(shí)時(shí)成

4、像方法，對(duì)這兩個(gè)重要的細(xì)胞生物學(xué)過程中的特定分子進(jìn)行實(shí)時(shí)追蹤，并進(jìn)一步結(jié)合到微流控芯片模擬腫瘤微環(huán)境的研究中，考察腫瘤微環(huán)境影響因素pH對(duì)腫瘤干細(xì)胞分化侵襲的影響。具體內(nèi)容如下。
　　先構(gòu)建一種雙靶標(biāo)mRNA探針體系用于標(biāo)記細(xì)胞周期G1期停滯，通過針對(duì)G1期停滯調(diào)控相關(guān)的兩個(gè)關(guān)聯(lián)基因MYC和CDKN1A mRNA的實(shí)時(shí)成像，實(shí)現(xiàn)對(duì)G1停滯的識(shí)別，并基于該成像方法研究了HIF-α在G1期停滯調(diào)控中的作用。該法可用于追蹤單細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)

5、變化，結(jié)果直觀清晰，易于識(shí)別。綠色及紅色熒光的空間和時(shí)間分布變化可用于指示不同階段的周期停滯。我們將這種方法成功應(yīng)用于研究HIF-1α在區(qū)分“良性”和“不良”細(xì)胞周期停滯中的作用，證明其應(yīng)用于動(dòng)態(tài)觀察G1期阻滯的可靠性。
　　接著以實(shí)時(shí)研究細(xì)胞能量代謝狀態(tài)為目的，構(gòu)建極化ATP探針，用于研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)發(fā)生間葉性分化的能量代謝狀態(tài)變化。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)ATP的水平來反映是否發(fā)生能量代謝方式的改變;探針顯示的亞細(xì)胞分

6、布可反映細(xì)胞對(duì)氧化磷酸化和糖酵解途徑的依賴性。線粒體共定位ATP成像熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)現(xiàn)象提示，TGFβ的刺激能夠增強(qiáng)GSCs分化期間的氧化磷酸化作用。GSCs依賴于氧化磷酸化代謝方式，并且這種依賴性在分化的細(xì)胞中喪失，但通過對(duì)比添加TGFβ誘導(dǎo)分化的細(xì)胞與單純只由低含量FBS誘導(dǎo)分化的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，由TGFβ誘導(dǎo)分化發(fā)生較高比例的間葉性分化，這類細(xì)胞對(duì)氧化磷酸化的依賴有所增加。因此，我們通過能量代謝的熒光實(shí)時(shí)成像發(fā)現(xiàn)了間葉性分化GSCs相比其

7、他分化的GSCs具有較高的氧化磷酸化依賴性;該法具有實(shí)時(shí)成像分析的特點(diǎn)，在研究處于不同階段的細(xì)胞的能量代謝中體現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。
　　最后基于微流控芯片平臺(tái)構(gòu)建三維細(xì)胞侵襲模型。在腫瘤干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)及與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下，由上述熒光成像方法輔助研究pH對(duì)腫瘤干細(xì)胞分化侵襲行為的影響。在我們的侵襲模型中，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)的硬度抑制了細(xì)胞以變形蟲模式遷移，也正如我們觀察到的，大多數(shù)侵襲的細(xì)胞表現(xiàn)出間充質(zhì)樣形態(tài)。在pH梯度下，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)生侵