炎癥對(duì)骨折愈合過程中成骨細(xì)胞分化的影響及分子機(jī)制.pdf

1、一、研究背景
　　 骨折愈合過程如果伴隨感染可導(dǎo)致愈合明顯延遲甚至骨不連發(fā)生。骨形成過程就是骨骼中的成骨細(xì)胞活性與破骨細(xì)胞活性這一相互拮抗、制約的矛盾統(tǒng)一體的平衡過程,其中成骨細(xì)胞的作用為合成骨基質(zhì),由間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymalStem Cell,MSCs)分化而來；破骨細(xì)胞的作用為降解骨基質(zhì),由骨髓單核巨噬細(xì)胞分化演變而成。骨折愈合過程中需要大量新的成骨細(xì)胞產(chǎn)生,從而加快骨質(zhì)合成與鈣化,增加骨的體積和密度。慢性持續(xù)性

2、炎癥可刺激骨吸收,此方面研究已較成熟。但慢性持續(xù)性炎癥對(duì)骨形成過程中成骨細(xì)胞分化的影響,尤其是對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞過程的影響至今卻所知甚少,目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏研究,而此類研究對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐具有重要意義。核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB(nuclear factorkappa B)是炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥反應(yīng)中扮演著舉足輕重的關(guān)鍵角色。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)、核心結(jié)合因子(Runt

3、-relatedtranscription factor2,Runx2)等信號(hào)通道是控制成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。因此,本課題重點(diǎn)研究NF-κB對(duì)成骨細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的BMP-Smad通道、Runx2信號(hào)通道的影響,并探索拮抗炎癥因子活性進(jìn)而有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的化合物,是以全新方位研究促進(jìn)骨折愈合的新思路。
　　 炎癥分為細(xì)菌性和無菌性炎癥。細(xì)菌毒素(如LPS)及細(xì)胞碎片和外來物(如金屬固定架和固定髓內(nèi)針、鋼板引入的金屬顆粒等

4、)均可刺激細(xì)胞產(chǎn)生很多細(xì)胞因子(如TNF-α等),進(jìn)而誘導(dǎo)激活炎癥反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB等,從而發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)。NF-κB是炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,它控制著很多與細(xì)胞生存與繁殖有關(guān)的基因的表達(dá),在炎癥反應(yīng)中扮演著舉足輕重的關(guān)鍵角色。NF-κB是由p65和p50兩個(gè)亞單位組成的符合體,IκBα(IKappa B alpba)通過與NF-κB結(jié)合而使其失去活性,而TNFα、LPS等可以通過激活NF-κB抑制蛋白激酶(IκB K

5、inase,IKK),使IκBα磷酸化并最終降解,從而釋放NF-κB復(fù)合物,使其得以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),通過與其下游信號(hào)蛋白及其啟動(dòng)子的結(jié)合而激活其表達(dá)。
　　 當(dāng)骨折發(fā)生時(shí),附近骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)和損傷部位的各種細(xì)胞因子刺激激活下發(fā)育分化成為成骨細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞分化發(fā)育形成成骨細(xì)胞的過程存在著一個(gè)復(fù)雜精密的調(diào)節(jié)體系,涉及多個(gè)骨生成有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道,如BMP-Smad,Runx2/Cbfa1、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(

6、Osterix)、基因啟動(dòng)子(Lrp5)等,其中骨特異的轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix作用極為關(guān)鍵。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,敲除Runx2基因的小鼠由于沒有骨的產(chǎn)生而不能存活,Osterix也是一樣,它們是成骨細(xì)胞分化的主控制開關(guān),作用尤其重要。Runx2和Osterix的調(diào)控有很多機(jī)制,BMP-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是其中之一,細(xì)胞外的BMP-2通過與細(xì)胞膜表面的BMP受體結(jié)合并激活受體,BMP受體位于細(xì)胞內(nèi)的部分可以磷酸化激活Smad1

7、、Smad5或Smad8,使其與Smad4結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞核,通過對(duì)多種相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道(包括Runx2和Osterix)的影響,從而誘導(dǎo)多種骨形成有關(guān)的蛋白質(zhì)活化而刺激骨形成。由于BMP-Smad、Runx2等信號(hào)通道是控制成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素,本課題以BMP2誘導(dǎo)肌源前體細(xì)胞C2C12分化形成成骨細(xì)胞為模型,研究炎癥因子TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響及其規(guī)律、分子機(jī)制和可能的改善措施,重點(diǎn)研究NF-κB對(duì)成骨細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的B

8、MP-Smad通道、Runx2信號(hào)通道的影響,并探索有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化拮抗炎癥因子活性的新措施,對(duì)今后更好的指導(dǎo)臨床實(shí)踐中骨折愈合具有極為重要的意義。
　　 二、研究目的：
　　 1.研究炎癥因子對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響及其規(guī)律:炎性因子TNF-α對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分化的影響及其規(guī)律。
　　 2.研究炎癥因子影響成骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制:通過炎癥有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和其超級(jí)拮抗物IκBα-SR對(duì)成骨細(xì)胞分化過程

9、中各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(包括BMP-Smad通道和Runx2通道)的影響,來確定其作用途徑和分子機(jī)制。
　　 3.研究NEMO結(jié)合域(NBD)多肽改善TNF-α抑制成骨細(xì)胞分化的效果。
　　 三、研究方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)與傳代:
　　 C2C12細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基(含10％小牛血清)中,于5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),溫度37℃。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均接種于12孔培養(yǎng)板上貼壁培養(yǎng)。
　　 2.成

10、骨細(xì)胞分化測(cè)定-ALP染色:
　　 C2C12細(xì)胞用BMP-2(100ng/ml)、TNF-α(5ng/ml)處理。組織化學(xué)染色:ALP檢測(cè)盒(美國(guó)Sigma公司)按常規(guī)指示ALP活性。每3天更換培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)7天后,用PBS磷酸鹽緩沖溶液清洗細(xì)胞,用混合萘酚AS-BI堿性溶液培養(yǎng)和茜素紅染色定性檢測(cè)鈣礦沉積情況。紅色不可溶解的顆粒物提示ALP活性的水平；定量分析:培養(yǎng)3天后細(xì)胞溶解,細(xì)胞ALP活性用熒光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sig

11、ma公司)檢測(cè),應(yīng)用4-硝基苯基磷酸二鈉鹽(4-nitrophenyl phosphate hexahydrate,PNPP)法依說明書檢測(cè)。
　　 3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和基因測(cè)定:
　　 將C2C12細(xì)胞接種在12孔板內(nèi),含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)之后,采用Superfect試劑(Qiagen)并依照其說明分別用1μg的12×SBE-Luc,pCMV-Smad1,pCMV-NFκB(p65)或pCMV-IκB

12、α質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,DNA總量由添加空白質(zhì)粒均衡。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中用BMP-2(100 ng/ml)和TNF-α(5 ng/ml)培養(yǎng)48小時(shí)后,用pH 7.4的PBS清洗細(xì)胞3次,RIPA溶液溶解細(xì)胞,其螢光素酶活性用熒光素酶分析系統(tǒng)(Promega,Madison,USA)和Victor2多能計(jì)數(shù)儀(PE,Waltham,MA)測(cè)定。用于監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染率的β-半乳糖苷酶β-gad通過β-半乳糖苷酶的酶分析系統(tǒng)測(cè)定(prom

13、ega)。
　　 4.實(shí)時(shí)PCR測(cè)定(real-timePCR):
　　 將C2C12細(xì)胞接種于12孔板中培養(yǎng),采用上述細(xì)胞培養(yǎng)方法,在培養(yǎng)基中分別或聯(lián)合加入BMP-2(100 ng/ml)和TNF-α(5 ng/ml)進(jìn)行培養(yǎng)。48小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。采用TRIzol提取液(Invitrogen公司)提取總的RNA。應(yīng)用總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。鼠Smadl特殊上游引物為5-GCTTCGT

14、GAAGGGTTGGG-3’,下 游 引 物 為5`-CGGATGAAATAGGATGTGGGG-3`。反應(yīng)條件為:50℃ 2分鐘,95℃10分鐘；然后95℃ 15秒,60℃ 30秒,共40次循環(huán)。用ABI Prism公司的7000序列檢測(cè)系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。以GAPDH為內(nèi)參,通過AACT方法分析基因表達(dá)結(jié)果。至少重復(fù)進(jìn)行三次單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。
　　 5.十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡法(West

15、ern blotting):
　　 將C2C12細(xì)胞接種于12孔板中,用10％胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí),之后用無血清培養(yǎng)基替代,并加入BMP-2(100 ng/ml)和/或TNF-α(5 ng/ml),分別培養(yǎng)1、3、6小時(shí)。細(xì)胞用RIPA緩沖液溶解。同等數(shù)量總細(xì)胞溶解產(chǎn)物用磷酸化的Smadl(Scr463/Ser465)抗體及β-肌動(dòng)蛋白抗體(β-actin)進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析。β-

16、actin作為內(nèi)參對(duì)照。
　　 6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料計(jì)算均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,多組均數(shù)比較采用單向方差分析,多組均數(shù)多重比較方差齊性采用SNK法,方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2法,實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)Smad1 mRNA表達(dá)用重復(fù)測(cè)量方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05,以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有意義。
　　 四、結(jié)論
　　 在創(chuàng)傷骨折和類

17、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中持續(xù)性的炎癥和感染的存在影響骨再生。其影響機(jī)制尚不十分清楚,阻止炎癥因子抑制骨再生可能是潛在的治療方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在C2C12細(xì)胞中TNF-α能抑制成骨細(xì)胞分化,并且TNF-α對(duì)BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化和其對(duì)骨誘導(dǎo)信號(hào)的抑制具有量效相關(guān)性。此抑制作用可能是通過阻斷BMP2-Smad1信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。階梯實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNF-α-NF-kB信號(hào)通路可以抑制BMP2-Smad1信號(hào)通路,TNF-α能減弱Smad1活性但并不