胸腺增齡性萎縮過程中胸腺基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：胸腺是人體重要的中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的場(chǎng)所。但是，胸腺會(huì)隨著年齡的增長發(fā)生增齡性的萎縮，主要表現(xiàn)為胸腺體積變小、胸腺組織結(jié)構(gòu)破壞、胸腺上皮細(xì)胞數(shù)量減少和脂肪細(xì)胞數(shù)量增加，從而導(dǎo)致幼稚T淋巴細(xì)胞的輸出減少，使得老齡人罹患腫瘤、感染以及自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。脂肪細(xì)胞的累積是胸腺增齡性萎縮的主要特征之一。目前，胸腺組織中脂肪細(xì)胞的來源存在爭(zhēng)議。越來越多的證據(jù)表明，胸腺基質(zhì)細(xì)胞(thymic stromal ce

2、ll，TSC)轉(zhuǎn)分化是胸腺組織中脂肪細(xì)胞的主要來源。然而，TSC向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制尚不十分清楚。因此，研究胸腺脂肪細(xì)胞形成的機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步探討胸腺增齡性萎縮的發(fā)生機(jī)制，并開發(fā)促進(jìn)胸腺再生的有效手段，延緩衰老，改善和提高老齡人口健康水平具有重要意義。
　　方法：利用過氧化物酶體增殖激活物受體γ(peroxisomeproliferators-activated receptorγ，PPARγ)的配體羅格列酮，將體外培養(yǎng)的O

3、P9-DL1細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)處理的細(xì)胞作為對(duì)照。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）的非靶向代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)非標(biāo)記(label-free)定量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞內(nèi)差異的小分子代謝產(chǎn)物和差異表達(dá)的蛋白。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督主成分分析(principal compone

4、nts analysis，PCA)，有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析(partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA)等多維統(tǒng)計(jì)分析，并以變量權(quán)重值(variable importance in the proje

5、ction，VIP)大于1且單變量統(tǒng)計(jì)分析中的P值小于0.05作為篩選差異代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)。蛋白組學(xué)則以差異倍數(shù)大于2或小于0.5且P值小于0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析、基因本體(gene ontology, GO)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析。此外，我們?cè)谟昧_格列酮將OP9-DL1細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞的同時(shí)，添加轉(zhuǎn)化生長因子β1(transfo

6、rming growth factor-β1，TGF-β1)進(jìn)行干預(yù)。油紅O染色和AdipoRed染色觀察脂肪細(xì)胞的形成。Real-time PCR檢測(cè)PPARγ、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein4，F(xiàn)ABP4）、β-catenin、Dvl1、Dvl3、Fzd2和Axin2的mRNA表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)PPARγ、β-catenin和Axin2的蛋白表達(dá)水平。染色質(zhì)免疫沉淀(chr

7、omatin immunoprecipitation，ChIP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Smad2/3、組蛋白去乙?；?(histone deacetylase1，HDAC1)和H3K14ac與PPARγ基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。免疫熒光染色檢測(cè)β-catenin在OP9-DL1細(xì)胞中的定位。油紅O染色檢測(cè)TGF-β特異性抑制劑LY-364947和Wnt通路抑制劑IWR-1對(duì)羅格列酮誘導(dǎo)的OP9-DL1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的影響。我們?cè)囵B(yǎng)TSC，用

8、羅格列酮將其誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞，同時(shí)用TGF-β1進(jìn)行干預(yù)，油紅O染色檢測(cè)脂肪細(xì)胞的形成情況。蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察2月齡和12月齡小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)，并用免疫熒光染色比較2月齡和12月齡小鼠胸腺組織中TGF-β1、PPARγ、Axin2和β-catenin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：⑴PCA和PLS-DA分析顯示DMSO和羅格列酮處理的兩組細(xì)胞樣本在二維圖上有明顯的分離趨勢(shì)；⑵LC-MS一共

9、篩選出33個(gè)差異小分子代謝產(chǎn)物。其中，與DMSO處理的細(xì)胞樣本相比，8個(gè)代謝產(chǎn)物，包括尿苷酸、硫胺、泛酸酯、甲基腺苷、鳥嘌呤核苷、鳥嘌呤、胞嘧啶核苷5'-二磷酸膽堿、磷酸膽堿，在羅格列酮處理的細(xì)胞樣本中水平升高，而其他的25個(gè)代謝產(chǎn)物，主要為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、氨基酸和核酸等則在羅格列酮處理的細(xì)胞樣本中水平降低；⑶非監(jiān)督層次聚類分析顯示同組樣本聚在同一簇中，并且聚在同一簇內(nèi)的小分子代謝產(chǎn)物具有相似的表達(dá)模式；⑷KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些小分

10、子代謝產(chǎn)物在甘油磷脂代謝通路和氮代謝通路顯著富集；⑸蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)一共篩選得到139個(gè)差異表達(dá)蛋白。其中，與DMSO處理的細(xì)胞相比，87個(gè)蛋白在羅格列酮處理的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而另外52個(gè)蛋白則在羅格列酮處理的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；⑹非監(jiān)督層次聚類分析顯示同組樣本聚集在同一簇內(nèi)，并且聚在同一簇內(nèi)的蛋白具有相似的表達(dá)模式；⑺油紅O和AdipoRed染色結(jié)果顯示DMSO對(duì)照組中幾乎未見脂肪細(xì)胞，羅格列酮單獨(dú)處理組則出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞，而在同時(shí)給

11、予羅格列酮和TGF-β1處理的細(xì)胞中脂肪細(xì)胞數(shù)量則明顯減少；⑻Real-time PCR結(jié)果表明在羅格列酮處理的OP9-DL1細(xì)胞中，PPARγ和FABP4的mRNA表達(dá)水平顯著上升，而給予0.1 ng/mL和0.2ng/mL的TGF-β1處理則可以顯著抑制羅格列酮誘導(dǎo)的PPARγ和FABP4 mRNA表達(dá)水平上升；⑼TGF-β1可以下調(diào)OP9-DL1細(xì)胞中PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)水平；⑽TGF-β1可以使OP9-DL1中Smad

12、2/3和HDAC1與PPARγ啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合增強(qiáng)，而使H3K14ac與PPARγ啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合減弱；⑾羅格列酮對(duì)OP9-DL1細(xì)胞中β-catenin和Dvl1的mRNA表達(dá)水平以及Axin2的mRNA和蛋白水平?jīng)]有顯著影響，但卻顯著下調(diào)了Dvl3和Fzd2的mRNA以及β-catenin的蛋白表達(dá)水平，TGF-β1可以部分逆轉(zhuǎn)羅格列酮對(duì)Axin2和β-catenin的蛋白表達(dá)水平的作用；⑿TGF-β1可以促進(jìn)OP9-DL1細(xì)胞中β-c

13、atenin從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核；⒀TGF-β1可以抑制羅格列酮誘導(dǎo)OP9-DL1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，而TGF-β特異性抑制劑LY-364947和Wnt通路抑制劑IWR-1均可部分逆轉(zhuǎn)這種抑制作用；⒁TGF-β1可以抑制羅格列酮誘導(dǎo)的原代TSC向脂肪細(xì)胞分化；⒂HE染色顯示與2月齡小鼠的胸腺組織相比，12月齡小鼠的胸腺組織可見空泡樣結(jié)構(gòu)（脂肪細(xì)胞）；⒃免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1在2月齡和12月齡小鼠胸腺組織中的表達(dá)沒有明顯的差異。而

14、PPARγ和Axin2在12月齡小鼠胸腺組織中的表達(dá)明顯高于其在2月齡小鼠胸腺組織中的表達(dá)。相反，與2月齡小鼠胸腺組織相比，12月齡小鼠胸腺組織中β-catenin的表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論：①代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)的方法篩選出了在羅格列酮誘導(dǎo)的OP9-DL1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中的差異小分子代謝產(chǎn)物和差異表達(dá)蛋白，我們對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。這些結(jié)果為我們后續(xù)研究OP9-DL1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制提供了線索；②TGF