Brd2在3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞分化過程中的作用及機制研究.pdf

1、脂肪組織主要由脂肪細胞所組成，過多的熱量攝入并以甘油三酯的形式儲存在白色脂肪細胞內(nèi)是肥胖發(fā)生的關(guān)鍵。前脂肪細胞的增殖分化是成熟脂肪細胞形成的核心，從前脂肪細胞分化成成熟的脂肪細胞的過程十分復雜，特別是機體內(nèi)多種細胞因子和激素在脂肪細胞發(fā)生過程中可能都有調(diào)節(jié)作用。
　　BRD2屬于BET蛋白家族，在哺乳動物細胞中廣泛表達，具有多種生物學功能，最新的研究表明Brd2基因突變能導致小鼠過度肥胖而不引起糖尿病，但是其作用的分子機制并不明確

2、。在本課題中，我們觀察了Brd2表達變化對前脂肪細胞向脂肪細胞分化過程的影響，并且重點研究了Brd2參與的信號通路在影響前脂肪細胞向脂肪細胞分化作用的分子機制，彌補了這一部分研究的空白。
　　在研究中，我們發(fā)現(xiàn)Brd2表達的下調(diào)，能促使3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞的分化，甚至在無任何誘導分化劑的情況下，部分細胞也能分化成脂肪細胞;相反的，當Brd2過表達時，即使誘導分化至第8天，細胞分化也幾乎完全被抑制。這就更加表明Brd2在

3、前脂肪細胞向脂肪細胞分化過程中有重要的作用，同時我們認為，上述現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于Brd2表達的變化影響了一些分化相關(guān)基因甚至是關(guān)鍵基因的表達。
　　為了研究Brd2表達的變化對脂肪細胞分化相關(guān)基因表達的影響，一方面我們利用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)3T3-L1前脂肪細胞內(nèi)Brd2的表達水平;另一方面運用將pmBrd2載體將Brd2基因?qū)?T3-L1前脂肪細胞，使細胞內(nèi)的Brd2過表達，然后先通過RT-PCR技術(shù)檢測了PPARγ和C/

4、EBPα的時序性表達，結(jié)果表明Brd2對脂肪細胞分化的兩個關(guān)鍵基因PPARγ和C/EBPα都有顯著的負調(diào)節(jié)作用;繼而運用Q-PCR技術(shù)，我們又檢測了其它相關(guān)基因的表達，結(jié)果顯示，422/aP2、Glut4、Leptin和Irs-1的表達都有顯著的改變，而Pfkfb1的表達則沒有受到明顯的影響。已有研究證明PPARγ是ERK的下游分子，當ERK通路激活后，PPARγ發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)錄活性降低從而抑制了分化，而Wang等的研究又證明了Brd2

5、可抑制PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性，由此我們首先推斷Brd2可能通過ERK信號通路影響脂肪細胞的分化;其次，Glut4表達的變化直接關(guān)系到細胞的糖攝取量，而在脂肪細胞中，與糖代謝密切相關(guān)的Insulin信號通路和AMPK信號通路都可刺激GLUT4的轉(zhuǎn)位，促進細胞對葡萄糖的攝取，其中Insulin信號是通過IGF-1R激活了IRS-1和IRS-2再進一步激活PI3K/Akt信號通路，最后作用于GLUT4;而在AMPK信號通路中，AICAR則可不依

6、賴于Insulin作用而直接激活AMPK，進而刺激GLUT4的轉(zhuǎn)位。在Wang等的研究中，Brd2缺失的小鼠進食量劇增，但其血糖水平并未隨攝糖量的急劇增加而升高，反而與野生型小鼠相比有所下降，因此，我們認為Brd2可能通過Insulin和AMPK信號通路來共同調(diào)節(jié)脂肪細胞的糖代謝。
　　為了證實Brd2是否通過ERK信號通路影響脂肪細胞的分化，我們先利用RNA干擾技術(shù)使3T3-L1細胞內(nèi)的Brd2基因沉默，然后再通過轉(zhuǎn)染pmBrd

7、2使細胞內(nèi)的Brd2過表達，隨后檢測Brd2表達的變化對ERK、Raf和JNK的磷酸化水平的影響，結(jié)果表明ERK的磷酸化水平有明顯的變化，但其上游的Raf則未受到明顯的影響，同時JNK信號通路也與此過程無關(guān);然后為了進一步確定ERK信號通路在該過程中的作用，我們觀察了ERK激酶MEK1的特異性化學抑制劑U0126對此過程的影響，結(jié)果表明U0126可使Brd2過表達的細胞部分恢復分化，同時aP2的表達也得以回調(diào)。綜合以上結(jié)果可證實:ERK

8、信號通路參與了Brd2調(diào)節(jié)3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞分化的過程，而JNK信號通路則與之無關(guān)。
　　同樣，為了證實Brd2可能通過Insulin和AMPK信號通路來共同調(diào)節(jié)脂肪細胞糖代謝，我們利用RNA干擾手段下調(diào)Brd2的表達后發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化水平明顯升高，而通過PI3K的特異性化學抑制劑LY294002可使Akt升高的活性降低，相反的，當Brd2過表達時，Akt的活性則受到了抑制;同時，在研究AMPK信號通路中，我們發(fā)現(xiàn)

9、Brd2具有負調(diào)節(jié)AMPK活性的作用:當Brd2表達下調(diào)時，AMPK的磷酸化水平明顯升高，而通過AMPK的特異性化學抑制劑Compound C和Insulin都可降低AMPK的升高的活性，反之，當Brd2過表達時，AMPK的活性則受到了抑制;并且當Brd2基因沉默時，PI3K的特異性化學抑制劑LY294002和AMPK的特異性化學抑制Compound C都能使GLUT4蛋白表達水平顯著下降。但是Brd2表達的變化對于GSK-3的活性卻并

10、不產(chǎn)生影響。由此，上述結(jié)果證實了我們的猜想:Brd2通過Insulin信號通路和AMPK信號通路調(diào)節(jié)3T3-L1前脂肪細胞GLUT4的表達，進而調(diào)節(jié)細胞對葡萄糖的攝取，但并不影響細胞的糖原合成。
　　綜上所述，在本研究中，我們證實了Brd2在3T3-L1前脂肪細胞中參與了ERK、Akt和AMPK信號通路，調(diào)控了某些相關(guān)基因的表達，影響了前脂肪細胞向脂肪細胞的分化和糖代謝，但對ERK、Akt和AMPK信號通路中涉及的有關(guān)轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)