KCTD15調(diào)控小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化的功能與作用機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的
　　肥胖癥是一種在遺傳和環(huán)境因素共同作用下,導(dǎo)致體內(nèi)脂肪堆積過多和(或)分布異常,體重增加的慢性代謝性疾病。在人群中進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)分析和動(dòng)物模型水平上的研究,證實(shí) KCTD15(potassium channel tetramerisation domain containing15)基因的變異與肥胖發(fā)生具有緊密相關(guān)性。以小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞為細(xì)胞模型的最新研究結(jié)果顯示 KCTD15基因在脂肪細(xì)胞分化的

2、前期具有重要作用,KCTD15基因敲低能夠抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化。但 KCTD15調(diào)控肥胖發(fā)生和脂肪細(xì)胞分化的潛在作用機(jī)制尚不清楚。本課題前期臨床研究顯示 KCTD15基因的 mRNA水平表達(dá)在超重、肥胖患者白色脂肪組織中較正常體重患者的白色脂肪組織中明顯降低。因此,本研究以小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞為細(xì)胞模型,綜合運(yùn)用 RNA干擾技術(shù)、表達(dá)譜芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法,篩查并鑒定 KCTD15基因敲低前后表達(dá)水平受顯著擾

3、動(dòng)基因。鑒定的潛在靶基因?yàn)檫M(jìn)一步闡明 KCTD15基因的功能,探討其肥胖相關(guān)性的作用機(jī)制,尋找新的肥胖癥治療的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞。
　　2.運(yùn)用 RNA干擾技術(shù),在小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中特異性敲低 KCTD15基因。
　　3.運(yùn)用半定量 RT-PCR和 Western-Blot技術(shù)檢測敲低前后 KCTD15基因表達(dá)水平。
　　

4、4.運(yùn)用表達(dá)譜芯片技術(shù)篩查差異表達(dá)基因。
　　5.運(yùn)用生物信息學(xué)方法對篩查的差異表達(dá)基因進(jìn)行 GO功能富集分析和 KEGG通路分析。
　　6.運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)基因的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1.運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),成功的培養(yǎng)了小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞。
　　2.半定量 RT-PCR和 Western-Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RNA干擾技術(shù)成功抑制了KCTD15基因的mRNA水平

5、和總體蛋白水平表達(dá)。
　　3.運(yùn)用表達(dá)譜芯片技術(shù),共篩查到386個(gè)下調(diào)基因和453個(gè)上調(diào)基因。除去芯片誤差,總共篩查到的差異表達(dá)基因有833個(gè)。
　　4.差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果:(1)按生物學(xué)過程 GO分析結(jié)果顯示:差異表達(dá)基因的功能主要富集在生物膜組裝、細(xì)胞骨架組裝、染色體組裝、細(xì)胞黏附、脂肪細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)代謝以及免疫過程上;(2)按照差異基因編碼蛋白的細(xì)胞定位 GO分析結(jié)果顯示:絕大多數(shù)差異表達(dá)基因編碼的蛋白

6、位于細(xì)胞骨架和生物膜上;(3)按照差異表達(dá)基因的分子功能 GO分析結(jié)果顯示:差異表達(dá)基因主要富集到細(xì)胞骨架的結(jié)合、調(diào)節(jié)核苷三磷酸酶的活性和酶抑制劑上;(4) KEGG通路分析結(jié)果顯示:差異表達(dá)基因主要可以富集到二羧酸代謝和半乳糖代謝2條通路中。
　　5.半定量 RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示:CUX1基因和 ABCA7基因的表達(dá)量升高, MTHFD1基因、MDH1基因和 VPS4B基因的表達(dá)量降低,與表達(dá)譜芯片測試結(jié)果一致。