HOXA6在HL60細(xì)胞增殖分化過程中的表達(dá)及干預(yù)研究.pdf

1、目的：本課題主要探討HL60細(xì)胞增殖分化過程中HOXA6mRNA的表達(dá)及HOXA6蛋白的分泌情況，用三氧化二砷（ATO）和/或全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）進(jìn)行干預(yù)，在基因水平探討ATO和/或ATRA對HL60細(xì)胞增殖分化過程中HOXA6mRNA的表達(dá)及HOXA6蛋白的分泌的影響。方法：1.HL60細(xì)胞株（購自維康生物有限公司）2.實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分4組：（1）空白對照組：HL60細(xì)胞對數(shù)生長期收

2、集細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至1×105/ml，加以等量的RPMI1640。（2）ATRA組：在培養(yǎng)體系分組中加入12ulATRA，終濃度1×10-6mol/l。（3）（3）ATO組：在培養(yǎng)體系分組中加入ATO，終濃度為1×10-6 mol/l。（4）ATRA+ATO組：加入ATRA、ATO，終濃度同上。3.采用腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以ATO和（或）ATRA持續(xù)干擾人類HL60細(xì)胞，觀正常組、ATRA組、ATO組、ATRA+ATO組的HL60細(xì)胞

3、第1天，2天和3天的分化情況。4.采用瑞氏姬姆薩染色法鑒定HL60細(xì)胞。5.第1天、第2天、第3天分別提取各組細(xì)胞總RNA，用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性。6.通過隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（fluorogenic quantitive reverse transcription polymenze chain reaction，F(xiàn)Q-RT-PCR）技術(shù)檢測HL60細(xì)胞增殖

4、分化過程中各組HOXA6基因的表達(dá)。7.隨機(jī)抽取逆轉(zhuǎn)錄的HOXA6基因進(jìn)行電泳分別獲得HOXA6基因在1天、2天、3天電泳圖。將HOXA6基因cDNA和ACTB基因陽性產(chǎn)物cDNA梯度稀釋制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各個樣本循環(huán)指數(shù)增長期的起始點(diǎn)即循環(huán)域值（cycle threshold，Ct）和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計算各自樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值，以ACTB基因作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化。8.PCR統(tǒng)計方法：結(jié)果用DNA相對拷貝數(shù)和RNA表達(dá)相對量（

5、2-△α）表示HOXA6基因相對內(nèi)參基因的表達(dá)量，采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（（）± s）表示HOXA6基因的變化情況。進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，REPEATED MEASURE方差分析，由統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS10.0完成。9.第1天、第2天、第3天分別裂解細(xì)胞提取各組細(xì)胞總蛋白。10.蛋白免疫印跡法（Western-blot）：分別檢測各組細(xì)胞中的HOXA6蛋白的表達(dá)：用BCA試劑盒測定樣品總蛋白濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、考馬斯亮藍(lán)

6、染色觀察蛋白條帶、電轉(zhuǎn)移（electrotransfer）、封閉PVDF膜、免疫反應(yīng)（加入一抗和二抗）、化學(xué)發(fā)光顯示目的條帶。11.圖像分析：將Western-blot結(jié)果傳送至計算機(jī)，用QUANTITY ONE圖像分析軟件系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析，得到積分光密度值，用內(nèi)參做校正，積分光密度值比值，代表蛋白相對表達(dá)量。12.Western-blot統(tǒng)計方法：分析各組細(xì)胞中HOXA6蛋白表達(dá)的差異，所有數(shù)據(jù)用（）±s，采用REPEATED

7、MEASURE方差分析，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為顯著差異。結(jié)果：1.HL60細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定，瑞氏姬姆薩染色法證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是HL60細(xì)胞，并可見藥物處理組明顯的粒系分化細(xì)胞。2.1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s，18s，28s三條帶型整齊，無明顯拖尾及彌散，說明RNA結(jié)構(gòu)完整，無明顯降解。3.逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增三組均有目的基因HOXA6和內(nèi)參照ACTB基因的cDNA的產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比示

8、擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為：HOXA6為126bp，ACTB基因?yàn)?11bp，與預(yù)定理論值大小符合。4.不同濃度ATRA處理細(xì)胞24h后，除5×10-6mol/l外其它濃度均會明顯抑制細(xì)胞增殖，并隨濃度的增加抑制作用也越顯著。不同濃度ATO處理細(xì)胞后，除10-7mol/l外其它濃度均會明顯抑制細(xì)胞增殖，并且濃度越大抑制作用出現(xiàn)的越早，效果越明顯。不同濃度ATRA、ATO聯(lián)合處理細(xì)胞后，均會明顯抑制細(xì)胞增殖，并且濃度越大抑制作用出現(xiàn)的越早，效果越

9、明顯。5.空白對照組HOXA6mRNA和HOXA6蛋白在HL60細(xì)胞中的表達(dá)呈逐漸增高的趨勢。6.ATRA組HOXA6mRNA和HOXA6蛋白表達(dá)增強(qiáng)，均高于正常組，其中第2天表達(dá)最強(qiáng)烈，第3天減弱。7.隨時間推移，ATO組和ATO+ATRA組HOXA6mRNA和HOXA6蛋白的表達(dá)在第1天最強(qiáng)烈（高于正常組），第2天和第3天表達(dá)下調(diào)（低于正常組）。8.與正常對照組比較，HOXA6mRNA和HOXA6蛋白受ATRA（1×10-6mol/

10、L）上調(diào)，而受ATO和ATO+ATRA先上調(diào)，然后下調(diào)。結(jié)論：1.1×10-6mol/L的ATRA、ATO及ATRA+ATO在誘導(dǎo)時間內(nèi)能促進(jìn)HL60細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化。2.HOXA6基因、HOXA6蛋白在人髓性白血病細(xì)胞HL60細(xì)胞增殖過程中有表達(dá)，隨著時間的推移表達(dá)增加，提示ATRA治療白血病的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HOX基因的表達(dá)有關(guān)。3.ATRA（1×10-6mol/L）在誘導(dǎo)時間內(nèi)能上調(diào)HOXA6基因和HOXA6蛋白的表達(dá)，提示ATR