HL-60細胞誘導分化后VEGF表達變化的分子機制研究.pdf

1、背景：
　　 作為目前已知最重要的正性血管生成調(diào)節(jié)因子，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)可以刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖，增強血管的滲透性，有利于腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。1971年Folkman首次提出腫瘤的血管生成(angiogenesis)這一觀點。不久VEGF信號通路就被確定為抗腫瘤治療的新靶點。人們對實體瘤中VEGF信號通路的研究比較深入，如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶Raf/MEK/ERK信號通路，PI3K/AKT信號通路，p38MAPK信

2、號通路，JNK/STAT信號通路，NF-κB信號通路，DLL4-Notch信號通路等。同樣在白血病中也存在明顯的血管新生現(xiàn)象，表現(xiàn)為骨髓微血管密度(MVD)的增高，并且伴有VEGF表達水平的升高。但是，白血病細胞VEGF表達分泌的機制，以及靶向VEGF調(diào)控在白血病細胞增殖分化中的作用至今沒有明確。
　　 目的：
　　 基于上述理論背景，本研究建立ATRA誘導急性早幼粒白血病細胞株HL-60細胞分化的模型，在該細胞模型中V

3、EGF表達水平下降，在此基礎上進一步探討VEGF表達調(diào)控的關(guān)鍵分子機制，從腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子出發(fā)，檢測其與VEGF表達的關(guān)聯(lián)性，篩選出調(diào)控VEGF表達的上游轉(zhuǎn)錄因子，探索新的基因靶點，擬為白血病的治療開辟新的治療道路。
　　 方法：
　　 取對數(shù)生長期的HL-60細胞，加入lμMATRA，于37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)96小時，Wright-Gimesa染色觀察HL-60細胞形態(tài)，硝基四唑氮藍(NBT)還原實驗檢

4、測HL-60細胞分化，流式細胞術(shù)檢測CDllb的表達和HL-60細胞周期，四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測HL-60細胞增殖，免疫細胞化學法檢測HL-60細胞VEGF、c-myc的表達，逆轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測CDllb、VEGF、HIF-1α、STAT3、c-myc、P53、VHL、COX-2、SP-1和AP-1mRNA的表達，蛋白質(zhì)印記(Westemblot)檢測細胞VEGF、STAT3、c-myc的蛋白表達。RN

5、A干擾（RNAi）檢測STAT3、c-myc與VEGF的關(guān)系，染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)進一步驗證c-myc與VEGF啟動子的結(jié)合情況。測定結(jié)果用x±s表示，均數(shù)比較采用f檢驗，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，P＜O.01為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 lμMATRA作用96小時可顯著抑制HL-60細胞的增殖，并出現(xiàn)明顯的分化現(xiàn)象，倒置顯微鏡下觀察到細胞明顯向成熟粒細胞方向分化；免疫細胞化

6、學法顯示VEGF表達量明顯下降；流式細胞術(shù)檢測細胞周期，處于G0/G1期的比例高達77.31％;流式細胞術(shù)檢測細胞表面標記CDllb表達水平明顯升高（P＜0.01）；NBT陽性率為82.59％(P＜0.01)；RT-PCR檢測VHL基因表達無明顯變化（p＞0.05），HIF-1α、P53、COX-2、SP-1和AP-1mRNA表達水平升高；RT-PCR及Westemblot檢測VEGF、STAT3和c-mycmRNA和蛋白表達水平均明顯

7、下降(P＜0.05);RNAi結(jié)果顯示阻斷c-myc基因的表達，VEGF基因的表達水平明顯下降(P＜0.05);ChIP實驗進一步驗證c-myc與VEGF啟動子的結(jié)合情況。
　　 結(jié)論：
　　 在ATRA誘導HL-60細胞分化的模型中VEGF的表達水平隨誘導分化的進程而下降，VEGF的下調(diào)可能與c-myc、STAT3具有顯著相關(guān)性，而且c-myc可能結(jié)合于VEGF啟動子區(qū)域，調(diào)控VEGF的表達。HIF-1α、P53、VH