維甲酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的鑒定及其蛋白功能的初步研究.pdf

1、RA在APML治療上的效果被認(rèn)為是由于誘導(dǎo)分化和克隆清除.對(duì)于相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制,Geary SM等的研究認(rèn)為維甲酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化后細(xì)胞免疫刺激能力增強(qiáng)以及表面某些粘附分子和共刺激分子的表達(dá)上調(diào).維甲酸作為分化療法治療APML的臨床藥物,可能的作用機(jī)理除了有利于免疫刺激的細(xì)胞表面分子的表達(dá)上調(diào),是否還與一些細(xì)胞蛋白的表達(dá)有關(guān)?蛋白質(zhì)組學(xué)研究是近年生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一.蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)和方法已在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病診斷

2、的分子標(biāo)記,以及藥物開(kāi)發(fā)研究等多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,并成為功能基因組研究的重要組成部分.用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析維甲酸誘導(dǎo)分化的HL-60細(xì)胞蛋白變化,有利于理解維甲酸作用機(jī)理.為此我們用比較蛋白質(zhì)組方法分析比較ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化并對(duì)部分差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)序鑒定.再根據(jù)蛋白鑒定結(jié)果,用RNA干擾技術(shù)對(duì)蛋白功能進(jìn)行初步研究.我們首先確定了ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的條件.為了分析分化細(xì)胞的蛋白表達(dá)變化,用13cm pH

3、3-10范圍的IPG膠條做IEF,雙向電泳分析HL-60和HR96(ATRA處理96小時(shí)的HL-60細(xì)胞)細(xì)胞蛋白表達(dá)變化,分別可檢測(cè)622±66和724±51個(gè)蛋白點(diǎn).在分子量約10kDa,pI4-5區(qū)域有兩個(gè)蛋白特異表達(dá)于HR96分化細(xì)胞中,而未分化的HL-60細(xì)胞不表達(dá).為了鑒定在HR96細(xì)胞蛋白中表達(dá)的兩個(gè)蛋白點(diǎn),最初試圖用Edman降解法進(jìn)行N-端自動(dòng)測(cè)序,但是兩個(gè)蛋白點(diǎn)都沒(méi)有出峰,可能這兩個(gè)蛋白的N-端氨基酸都有翻譯后修飾使

4、N-端封閉而不能Edman降解法測(cè)序,我們用nano-ESI-MS/MS進(jìn)行了進(jìn)一步分析.最后對(duì)S100A9在ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化中的作用進(jìn)行了初步研究.構(gòu)建了表達(dá)反義RNA的pLXSA9(R)以及表達(dá)siRNA的pLNSAi-1和pLNSAi-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體.分別在包裝細(xì)胞中形成病毒顆粒,病毒上清轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞經(jīng)ATRA處理后,用RT-PCR檢測(cè)ATRA處理細(xì)胞S100A9的表達(dá)情況,pLXSA9(R)幾乎完全抑