機(jī)械牽伸對(duì)大鼠TSCs MGF表達(dá)的影響及其對(duì)TSCs分化增殖的調(diào)控作用.pdf

1、肌腱病(Tendinopathy)是一種常見的多種因素引起的肌腱功能障礙的綜合征，其治療方式多樣，但總體治療效果有限，究其原因在于肌腱病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1-3]。肌腱干細(xì)胞(tendon stem cells，TSCs)作為肌腱來源的特殊干細(xì)胞在維持肌腱正常生理功能及肌腱病病理生理過程中都扮演重要角色。如何調(diào)控TSCs正常分化為肌腱細(xì)胞修復(fù)肌腱微損傷，對(duì)于提高肌腱病的防治水平具有重要意義。目前已研究證實(shí)TSCs可受多種因素調(diào)控，

2、如機(jī)械應(yīng)力、炎癥因子、皮質(zhì)醇激素、細(xì)胞因子等。在眾多調(diào)控因素中，機(jī)械應(yīng)力是肌腱病發(fā)病始動(dòng)因素，對(duì)于TSCs調(diào)控作用重要性不言而喻。
　　力生長因子(Mechano growth factor，MGF)，也稱為機(jī)械生長因子，廣泛存在于骨、骨骼肌、肌腱、腦等組織，是在受到機(jī)械應(yīng)力、電刺激或者組織損傷時(shí)產(chǎn)生的一種胰島素樣生長因子-1的選擇性剪接異構(gòu)體。自從MGF被發(fā)現(xiàn)以來，其獨(dú)特的E肽結(jié)構(gòu)及其特有的功能吸引著眾多學(xué)者的關(guān)注，現(xiàn)已證實(shí)MG

3、F對(duì)多種細(xì)胞的增殖、遷移及分化有重要作用。另外有研究發(fā)現(xiàn)肌腱組織經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激后，MGF表達(dá)會(huì)顯著升高，且反應(yīng)時(shí)間明顯早于IGF-1。然而，TSCs作為肌腱病發(fā)病過程中的“明星細(xì)胞”，在受到機(jī)械牽伸應(yīng)力作用后MGF表達(dá)水平如何變化以及MGF對(duì)其增殖分化及遷移能力是否起到一定的調(diào)節(jié)作用卻未見相關(guān)報(bào)道。同時(shí)，機(jī)械牽伸和MGF對(duì)于TSCs的分化調(diào)控是單獨(dú)作用還是共同作用？是相互協(xié)同作用還是拮抗作用呢？這一系列問題均亟待解決。
　　目的：

4、本課題研究目的主要是:1.驗(yàn)證機(jī)械牽伸對(duì)TSCs分化的調(diào)控及對(duì)MGF表達(dá)的影響;2.明確MGF對(duì)TSCs增殖、分化、遷移的影響及調(diào)控機(jī)制;3.闡明MGF在機(jī)械牽伸條件下對(duì)TSCs分化調(diào)控的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分:進(jìn)行大鼠TSCs分離培養(yǎng)鑒定;通過Real-time PCR、Western Blot分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測不同機(jī)械牽伸條件處理后TSCs中成骨、成脂及成肌腱分化的相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)水平，

5、同時(shí)檢測TSCs中MGF mRNA表達(dá)水平。
　　第二部分:通過CCK8及實(shí)時(shí)無標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)檢測TSCs經(jīng)不同濃度MGF處理后，細(xì)胞增殖變化情況;通過Transwell、劃痕試驗(yàn)及激光共聚焦顯微鏡檢測不同濃度MGF處理對(duì)TSCs遷移能力及細(xì)胞骨架變化的影響;通過Western Blot檢測TSCs經(jīng)不同濃度MGF及MAPK/ERK通路抑制劑PD98059處理后，成腱分化相關(guān)基因蛋白表達(dá)變化。
　　第三部分:通過Rea

6、l-time PCR和Western Blot分別檢測機(jī)械牽伸與MGF共同處理TSCs后，成肌腱、成骨及成脂三系分化相關(guān)基因mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分:
　　1.4％1Hz組牽伸48h成腱分化指標(biāo)TNC和成骨分化指標(biāo)RUNX2相對(duì)表達(dá)量較靜態(tài)培養(yǎng)組均顯著升高(P＜0.05);4％2Hz組各牽伸時(shí)間點(diǎn)TNC相對(duì)表達(dá)量較靜態(tài)培養(yǎng)組均明顯升高(P＜0.05)，同時(shí)牽拉24h時(shí)CEBPα表達(dá)受到顯著

7、抑制(P＜0.05)，RUNX2相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05);8％1Hz組牽拉24h RUNX2表達(dá)水平顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P＜0.05)，同時(shí)成肌腱分化及成脂肪分化相關(guān)基因表達(dá)較靜態(tài)培養(yǎng)組無顯著變化(P＞0.05);8％2Hz組牽拉48h時(shí)CEBPα表達(dá)水平顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P＜0.05)，同時(shí)RUNX2相對(duì)表達(dá)量較靜態(tài)培養(yǎng)組無顯著差異(P＞0.05)，TNC相對(duì)表達(dá)量較靜態(tài)培養(yǎng)組顯著降低(P＜0.05)。
　

8、　2.不同條件機(jī)械牽伸會(huì)引起TSCs中MGF mRNA相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)不同水平的增加。4％2Hz及8％1Hz組牽伸12小時(shí)即可見MGF mRNA水平顯著升高(P＜0.05)，牽伸24h時(shí)MGF mRNA表達(dá)量達(dá)到頂峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第二部分:
　　1.CCK-8結(jié)果顯示:TSCs經(jīng)5ng/ml MGF處理后，24小時(shí)開始OD值即出現(xiàn)顯著升高，與其余各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但其余各組間

9、吸光度無明顯差異(P＞0.05)。RTCA結(jié)果顯示:經(jīng)1ng/ml及5ng/ml MGF處理后，TSCs細(xì)胞指數(shù)較其余各組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05);經(jīng)10ng/ml、25ng/ml和50ng/ml MGF及5ng/ml MGF+10μ g/ml PQ401處理后，細(xì)胞指數(shù)較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05);5ng/mlMGF+50μ M PD98059組較其余各組，細(xì)胞指數(shù)明顯降低，差

10、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml MGF處理后，TSCs遷移能力較對(duì)照組均明顯加快，其中5ng/ml MGF處理組TSCs的遷移速度最快。Transwell結(jié)果顯示:TSCs經(jīng)過不同濃度MGF處理后，TSCs遷移數(shù)量均有顯著增加，OD值顯著升高(P＜0.05)，其中以5ng/ml和7.5ng/ml組最為明顯;另外5ng/ml MGF+50μ M PD98059

11、組與5ng/ml MGF組相比，TSCs遷移數(shù)量明顯減少，OD值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而5ng/ml MGF+10μg/ml PQ401組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞遷移數(shù)量最少，OD值最低。激光共聚焦顯微鏡觀察可見:經(jīng)0、1.0、2.5、5.0、7.5及10.0ng/mlMGF處理的TSCs，細(xì)胞骨架連續(xù)性良好，熒光強(qiáng)，細(xì)胞成典型長梭形，肌動(dòng)蛋白纖維排列規(guī)則;經(jīng)高濃度（25ng/ml及50ng/ml）MGF處理后，

12、TSCs形態(tài)成不規(guī)則形，細(xì)胞骨架斷裂，排列紊亂，熒光強(qiáng)度變?nèi)?經(jīng)10μ g/ml PQ401處理后，TSCs細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，細(xì)胞骨架斷裂，呈顆粒樣，熒光強(qiáng)度極弱。
　　3.Western Blot結(jié)果顯示TSCs經(jīng)5ng/ml及10ng/mlMGF處理72h后，TNC、SCX蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而經(jīng)1ng/ml及25ng/ml MGF處理后，蛋白表達(dá)較對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05

13、)。
　　第三部分:
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示:TSCs經(jīng)0ng/ml、2.5ng/ml以及5.0ng/ml MGF處理后，在4％2Hz機(jī)械牽伸條件下牽伸24h，SCX和TNC mRNA相對(duì)表達(dá)較靜態(tài)培養(yǎng)組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RUNX2、DLX5以及AP2、PPARγmRNA相對(duì)表達(dá)量較靜態(tài)培養(yǎng)組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。50μ M PD98059+5ng/mlMG

14、F組TSCs經(jīng)4％2Hz機(jī)械牽伸24h后，全部基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量較未添加抑制劑的5ng/ml MGF組變化倍數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.Western blot結(jié)果顯示:TSCs經(jīng)0、2、5ng/ml MGF處理后，在4％2Hz機(jī)械牽伸下牽拉24h，TNC蛋白相對(duì)表達(dá)量較靜態(tài)培養(yǎng)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RUNX2以及CEBPα蛋白相對(duì)表達(dá)量較靜態(tài)培養(yǎng)組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

15、P＜0.05)。50μ M PD98059+5ng/ml MGF組TSCs經(jīng)4％2Hz機(jī)械牽伸24h后，全部分化相關(guān)基因的蛋白相對(duì)表達(dá)量較未添加抑制劑的5.0ng/mlMGF組變化倍數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　第一部分:不同條件的機(jī)械牽伸會(huì)引起TSCs向不同方向分化。4％2Hz24h為誘導(dǎo)成肌腱分化的最佳牽伸條件，8％1Hz24h為誘導(dǎo)成骨分化的最佳牽伸條件，8％2Hz48h為誘導(dǎo)成脂肪分