剔毒護肝方及其拆方對大鼠骨髓干細胞增殖分化的影響.pdf

1、目的：骨髓干細胞是當(dāng)前成體干細胞研究的熱點，關(guān)于其多向分化潛能的研究更是層出不窮，在一定條件誘導(dǎo)作用下，可分化為多功能細胞，形成各種類型組織和器官，已有研究證實骨髓干細胞可向神經(jīng)細胞、心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝實質(zhì)細胞等轉(zhuǎn)化。體內(nèi)外研究已證明骨髓干在肝細胞生長因子(HGF)和肝內(nèi)微環(huán)境下可分化為肝實質(zhì)細胞。但利用中草藥誘導(dǎo)骨髓干細胞向肝系分化的尚少有研究。剔毒護肝方主要由黃芪、莪術(shù)、葉下珠經(jīng)一定比例配置而成，是導(dǎo)師聶廣教授經(jīng)長期臨床實踐

2、和動物體內(nèi)外實驗總結(jié)出的經(jīng)驗方。本研究采用剔毒護肝方及其拆方含藥血清對大鼠骨髓干細胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察其對骨髓干細胞增殖作用和向肝系分化的影響。 方法：Wistar大鼠40只，雄性，SPF級，體重220±20g，隨機分為7組：剔毒護肝方組、黃芪組、莪術(shù)組、葉下珠組、生理鹽水對照組、肝再生血清組、骨髓干細胞分離組，全部正常飲食。將剔毒護肝方組(1g/ml)及葉下珠(0.4g/ml)、莪術(shù)(0.3g/ml)、黃芪(0.3g/ml)組

3、、生理鹽水對照組，每日分別以10ml/kg體重灌喂大鼠。灌胃前在水浴箱內(nèi)加熱藥物，每天2次，連續(xù)3天，于第4天1次給予全日劑量，1h后，2％戊巴比妥鈉麻醉后下腔靜脈無菌取血，離心得到藥物血清，同組大鼠藥物血清混勻，經(jīng)56℃，30min滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈistar大鼠10只，腹腔2％戊巴比妥麻醉，固定于手術(shù)臺面，常規(guī)消毒腹部，鋪手術(shù)洞巾，于腹中線剪開約3cm，暴露大部分肝臟，手術(shù)切除肝左中右葉約占全肝的75％，術(shù)后灌服10％葡萄

4、糖水給予支持治療。于肝大部分切除術(shù)后24小時，從大鼠下腔靜脈采血，制備血清，-20℃冷藏備用。Wistar大鼠體重約260g，頸椎脫臼處死，置于75％酒精消毒10min。于無菌條件下取出兩側(cè)股骨，剪斷兩端骨骺，用L-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，細胞懸液1500rpm/min離心5min去除脂肪層。重懸細胞用比重為1.077g/ml的percoll分離液分離，取中間界面層，用L-DMEM培養(yǎng)液洗滌2次。苔盼藍計數(shù)，將細胞以1×106/m

5、l密度接種于培養(yǎng)瓶，于37℃，5％CO2培養(yǎng)。48h換液除去未貼壁細胞，每3d換液1次，待細胞長到基本80％融合，以1：2傳代。將生長第2代細胞以5×105/ml密度接種于96孔板，每孔100μl；第2天吸棄培養(yǎng)液，以含各組含藥血清或肝再生血清10％的培養(yǎng)液作用于骨髓干細胞48h后，每孔加入5mg/mlMTT試劑20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄培養(yǎng)液，再加入二甲基亞砜150μl，放震蕩器震蕩15min，使沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀(λ450

6、nm)測每孔OD值，實驗重復(fù)2次。通過噻唑氮藍(MTT)比色法檢測含藥血清處理48h對骨髓干細胞的增殖率。MTT比色法的基本原理是活細胞能代謝MTT形成藍色不溶解的甲瓚(Formazan)，甲瓚形成量與活細胞數(shù)及功能狀態(tài)呈正相關(guān)性。計算公式：細胞增殖率=(用藥組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100％。采用免疫組化法檢測骨髓干細胞肝系標(biāo)志(AFP、白蛋白)表達情況，取誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7天和14天的細胞，胰酶消化后細胞懸液滴于硅化玻片，

7、6h后4％多聚甲醛固定，3％H2O2去離子水浸泡15min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗4℃過夜，依次滴加二抗和DAB顯色，最后常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。分別取誘導(dǎo)培養(yǎng)后第7天的細胞并將細胞裂解和第14天培養(yǎng)上清，采用放射免疫定量分別檢測細胞裂解物和細胞上清中AFP、白蛋白分泌量，具體按試劑盒說明書操作。RT-PCR：引物設(shè)計。白蛋白，正義：5'ATACACCCAGAAAGCACCTC3'，反義：5'CACGAATTGTGCGAATG

8、TCAC3'，436bp；AFP，正義：5'AACAGCAGAGTGCTGCAAAC3'，反義：5'AGGTTTCGTCCCTCAGAAAG3'686bp；GAPDH，正義：5'ATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCA3'，反義：5'TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGGCC3'，1000bp。Trizon試劑提取細胞總RNA，擴增條件：50℃30min,94℃2min,95℃2min，(94℃50sec,56℃50s

9、ec,72℃1min,35cycles)，72℃10min。將擴增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳成像。最后從肝系功能方面檢測誘導(dǎo)細胞合成糖原情況。細胞鋪片同免疫組化，Carnoy固定液固定，0.5％高碘酸反應(yīng)15秒，無色品紅閉光反應(yīng)30min，偏亞硫酸鈉反應(yīng)15秒，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。 結(jié)果：經(jīng)各組血清培養(yǎng)48h后，剔毒護肝方組、黃芪組和肝再生血清組顯示對大鼠骨髓干細胞有增殖作用，增殖率分別10.4％、14.3％和2

10、6.5％。莪術(shù)和葉下珠組顯示對其抑制。免疫組化結(jié)果示剔毒護肝方組、黃芪組、肝再生血清組，AFP和白蛋白表達情況強于其它組，肝再生血清組明顯強于剔毒護肝方組和黃芪組，該兩組表達無明顯差異。放免定量結(jié)果示AFP定量剔毒護肝方明顯高于其它組，白蛋白定量示各組無明顯差異。RT-PCR未有陽性結(jié)果出現(xiàn)。糖原檢測示剔毒護肝方組、黃芪組、肝再生血清組可見糖原陽性表達。 結(jié)論：剔毒護肝方組、黃芪組含藥血清對骨髓干細胞有增殖作用，通過肝系細胞表型