地塞米松對大鼠肌腱干細胞增殖、分化和遷移的影響及其機制研究.pdf

1、目的：
　　通過選取糖皮質(zhì)激素的一種最具代表藥物地塞米松(dexamethasone，Dex)研究不同濃度Dex對大鼠肌腱干細胞(rat tendon stem cells，rTSCs)增殖、分化和遷移的影響;闡明Dex抑制rTSCs向肌腱細胞分化，促進肌腱干細胞向脂肪細胞分化，抑制肌腱干細胞遷移的機制，最終闡明糖皮質(zhì)激素導致肌腱自發(fā)斷裂、肌腱自身修復能力降低的機制及針對由此導致的肌腱斷裂尋找治療方案。
　　方法：
　

2、　(1)rTSCs分離、培養(yǎng)以及Dex對rTSCs增殖的影響
　　首先通過I型膠原酶消化和在顯微鏡下挑取克隆的方法對rTSCs進行分離，通過流式細胞鑒定技術(shù)對rTSCs表面標志物CD44、CD90以及通過免疫熒光對胞內(nèi)標志物Nucleostemin、SSEA-4進行鑒定，通過三系誘導對rTSCs成骨、成軟骨、成脂分化能力進行鑒定。通過CCK-8法研究不同濃度Dex對rTSCs增殖的影響，進一步通過Ki-67法研究1 uM Dex對

3、rTSCs增殖的影響。
　　(2)Dex對rTSCs分化的影響及其機制研究
　　1)Dex對rTSCs分化的影響
　　首先我們通過HE染色和抗I型膠原免疫組化染色比較了正常的人體跟腱組織和長期使用糖皮質(zhì)激素導致斷裂的跟腱組織，接著我們通過流式細胞技術(shù)研究了1uMDex對rTSCs中CD44和CD90陽性細胞比例的影響，qPCR檢測比較了不同濃度Dex對rTSCs成肌腱分化轉(zhuǎn)錄因子Scx和成脂分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα m

4、RNA表達的影響。通過qPCR和WB檢測成肌腱分化標志物Ⅰ型膠原(typeⅠ collagen，ColⅠ)、tenomodulin(TNMD)和成脂分化標志物ap2、CCAAT-enhancer-binding proteinsα(C/EBPα)mRNA的表達和ColⅠ、ap2、C/EBPα蛋白的表達，通過觀察細胞形態(tài)變化、油紅染色和通過免疫熒光染色檢測ColⅠ、ap2來研究Dex對rTSCs分化的影響。
　　2)scleraxi

5、s(Scx)在Dex抑制rTSCs向肌腱細胞分化的作用
　　首先通過抗Scx免疫組化染色比較了正常人體跟腱組織和因長期使用糖皮質(zhì)激素導致斷裂的跟腱組織Scx表達的差異，接著通過體外實驗研究Dex對rTSCs表達Scx的影響以及Dex通過糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)與Scx基因啟動子上游可能的結(jié)合位點，通過轉(zhuǎn)染Scx過表達和干擾質(zhì)粒后，通過觀察rTSCs形態(tài)變化以及通過qPCR檢測成肌腱分化

6、標志物ColⅠ、TNMD的表達，研究Scx在Dex抑制rTSCs成肌腱分化中的作用，通過Gene-mapper和ChIP-sequence預(yù)測GR與Scx基因上游2000bp可能的結(jié)合位點，進一步通過ChIP-PCR驗證預(yù)測的結(jié)合位點是否為GR與Scx上游DNA片段真正的結(jié)合位點。
　　3)DKK1/GSK-3β/β-catenin在Dex促進rTSCs向脂肪細胞分化的作用
　　Dex作用rTSCs以后，通過qPCR篩選經(jīng)典

7、與非經(jīng)典的WNT信號通路配體，發(fā)現(xiàn)DKK1高表達。通過轉(zhuǎn)染DKK1 shRNA干擾質(zhì)粒以及Licl處理后，通過WB檢測P-GSK-3β(ser9)和P-GSK-3β(tyr216)以及活性β-catenin的蛋白變化，分別采用qPCR和WB方法檢測成脂分化標志物ap2、C/EBPα mRNA和蛋白的表達以及通過油紅染色檢測成熟的脂肪細胞形成研究DKK1/GSK-3β/β-catenin在Dex誘導rTSCs成脂分化中的作用。
　　

8、(3)Dex對rTSCs遷移的影響及其機制研究
　　1)Dex對rTSCs遷移的影響
　　將1uM Dex作用于rTSCs，采用鬼筆環(huán)肽染色研究了Dex對rTSCs細胞骨架的影響，通過劃痕實驗、transwell實驗觀察Dex對rTSCs橫向和縱向遷移的影響。
　　2)ROCK1和ROCK2在Dex抑制rTSCs遷移的作用
　　首先通過qPCR和WB研究了Dex對ROCK1和ROCK2 mRNA和蛋白表達的影響，

9、使用ROCKs分了的抑制劑Y-27632以及ROCK2慢病毒干擾作用于rTSCs以后，通過細胞劃痕實驗和transwell實驗研究ROCK1和ROCK2在Dex抑制rTSCs遷移中的作用。
　　結(jié)果：
　　1、rTSCs表達間充質(zhì)干細胞表面標志物及具有多向分化潛能
　　本課題組從大鼠跟腱分離的P0代肌腱干細胞呈現(xiàn)鵝卵石樣，通過流式細胞鑒定發(fā)現(xiàn)細胞群體中CD44和CD90陽性細胞數(shù)均超過90％以上，而通過免疫熒光染色檢測

10、SSEA-4和Nucleostemin發(fā)現(xiàn)，SSEA-4在胞漿中表達，而Nucleostemin在胞核中大量表達。肌腱干細胞經(jīng)過成骨、成脂、成軟骨培養(yǎng)誘導21天以后，分別通過茜素紅染色、油紅染色、甲苯胺藍染色檢測發(fā)現(xiàn)，本課題組分離得到的rTSCs具有向成骨、成脂、成軟骨分化的能力。
　　2、低濃度Dex促進rTSCs增殖，高濃度Dex抑制rTSCs增殖
　　使用0nM、1nM、10nnM、100nM、1uM Dex處理rTS

11、Cs6h、12h、24h、48h，通過CCK-8試劑處理檢測發(fā)現(xiàn)，10nM Dex促進rTSCs增殖，1uM Dex抑制rTSCs增殖。12h、24h、48h后，1nM、10nM Dex促進rTSCs增殖，而100nM、1uM抑制rTSCs增殖。通過抗Ki-67免疫熒光染色檢測進一步證實1uM Dex抑制rTSCs增殖。
　　3、Dex抑制rTSCs向肌腱細胞分化，促進其向脂肪細胞分化
　　HE染色和抗Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)

12、果顯示正常跟腱組織膠原纖維排列整齊、緊密，I型膠原高表達，而糖皮質(zhì)激素導致斷裂的跟腱組織中膠原纖維素排列紊亂、疏松，其間有類似脂肪組織化生，Ⅰ型膠原表達量降低。正常培養(yǎng)和Dex作用3天以后，CD44和CD90陽性細胞比例均較3天前顯著降低，Dex組較正常培養(yǎng)組CD44和CD90陽性細胞比例顯著降低。
　　4、Dex通過Scx抑制rTSCs向肌腱細胞分化
　　將1uM Dex作用rTSCs1、3、5、7天，Scx表達顯著降低，

13、而采用GR拮抗劑Mi處理以后，Mi能拮抗Dex誘導的Scx表達降低。作用7天后，Dex從蛋白水平抑制Scx表達，Mi能拮抗Dex誘導的Scx表達降低。說明Dex通過與GR結(jié)合抑制Scx表達。
　　5、Dex通過DKK1/GSK-3β/β-catenin促進rTSCs向脂肪細胞分化
　　將1uM Dex作用rTSCs3、5、7、14天，通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Dex組較對照組上調(diào)DKK1的表達，而通過WB檢測發(fā)現(xiàn)Dex也從翻譯水

14、平上調(diào)DKK1的表達。
　　6、Dex抑制rTSCs遷移
　　將1 uM Dex作用rTSCs24h后，通過細胞劃痕實驗和細胞transwell實驗發(fā)現(xiàn)，Dex顯著抑制rTSCs遷移，同時我們發(fā)現(xiàn)Dex作用rTSCs1、3、5、7天，通過qPCR和WB檢測發(fā)現(xiàn)，Dex組較對照組顯著升高ROCK1和ROCK2 mRNA和蛋白的表達，不改變RhoA的表達。
　　7、ROCKs在Dex抑制rTSCs遷移的作用
　　通過

15、劃痕實驗和transwell遷移實驗研究了Dex與Y27632對rTSCs遷移的影響，劃痕12h、24h后，分別在顯微鏡下結(jié)果顯示:Y27632加快rTSCs的側(cè)向遷移，減弱Dex對rTSCs側(cè)向遷移的抑制作用。將小室放在24孔板24h后，通過結(jié)晶紫染色在顯微鏡下結(jié)果顯示:Y27632加快rTSCs的縱向遷移，減弱Dex對rTSCs縱向遷移的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1、本實驗以酶消化法成功分離獲得了rTSCs，獲得的細胞

16、形態(tài)和免疫表型及多向分化能力符合MSCs的表型特征。本研究結(jié)果提示低濃度(1nM、10nM)Dex顯著促進rTSCs增殖，而高濃度(100nM、1uM)Dex顯著抑制rTSCs增殖。
　　2、本實驗證實低濃度Dex促進rTSCs成肌腱分化的轉(zhuǎn)錄因子Scx表達，抑制成脂肪細胞分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的表達，而高濃度Dex抑制rTSCs表達Scx，促進其其表達C/EBPα。高濃度Dex作用于受體以后，受體與成肌腱分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Sc

17、x的啟動子上游-726～-734堿基GGCAAGGT結(jié)合，抑制其表達，從而抑制rTSCs向肌腱細胞分化。我們的結(jié)果證實Dex誘導的rTSCs向脂肪細胞分化是由DKK1/GSK-3β/β-catenin介導的。DKK1的下調(diào)或者GSK-3β抑制劑是拮抗糖皮質(zhì)激素誘導肌腱干細胞向脂肪細胞分化的靶點。
　　3、本實驗證實Dex改變rTSCs細胞骨架結(jié)構(gòu)，抑制rTSCs橫向和縱向遷移。本實驗證實Dex通過上調(diào)ROCKs抑制rTSCs遷移，