適度牽伸應(yīng)力對老齡大鼠TSCs的作用及其對肌腱損傷修復(fù)作用研究.pdf

1、研究背景：
　　肌腱為連接著肌肉和骨的結(jié)締組織，其將肌肉收縮產(chǎn)生的力傳導(dǎo)至骨，產(chǎn)生運動并維持著靜息狀態(tài)時姿勢。肌腱因為經(jīng)常承受著牽伸負荷容易導(dǎo)致肌腱纖維微損傷，最終導(dǎo)致肌腱病。老齡化已經(jīng)被證實為肌腱病的一個重要影響因素，另外老齡化還導(dǎo)致肌腱損傷后修復(fù)困難以及修復(fù)后不能達到正常的力學(xué)性質(zhì)和功能狀態(tài)。當(dāng)前針對老齡化導(dǎo)致的肌腱病治療選擇相當(dāng)有限并且往往臨床效果不佳，主要原因是對老齡化導(dǎo)致的肌腱病的認識仍有待深入。既往研究已經(jīng)揭示了一些老

2、齡化肌腱的結(jié)構(gòu)改變以及發(fā)病的分子機制，然而老齡化肌腱中肌腱干細胞如何變化，以及適度機械牽伸對老齡化肌腱損傷的愈合究竟起何作用仍沒有定論。本研究的目的是嘗試通過明確老齡化肌腱干細胞的特性，研究適度體外牽伸和適度跑臺訓(xùn)練對老齡化肌腱干細胞的影響，探討適度適度跑臺訓(xùn)練對老齡化肌腱損傷愈合的作用，最終能夠為老齡化肌腱病的臨床治療提供一些線索和啟示。
　　材料與方法：
　　24只20月齡Fisher雌性老齡大鼠和6只2月齡Fisher

3、雌性成年大鼠被應(yīng)用于本課題研究。首先老齡大鼠和成年大鼠各6只用以比較老齡和成年大鼠髕腱來源肌腱干細胞干性、增殖能力和分化特征的差異;然后我們比較觀察了老齡大鼠髕腱來源肌腱干細胞在4％適度牽伸后肌腱干細胞發(fā)生的變化;接著18只老齡大鼠被隨機分配至適度跑臺訓(xùn)練組和籠中自由活動組，每組各9只。第1周老齡大鼠跑臺訓(xùn)練方案為:13米/分鐘，15分鐘/天，5天/周;第2-4周老齡大鼠跑臺訓(xùn)練方案為:13米/分鐘，30分鐘/天，15分鐘/天，5天/周

4、。老齡大鼠跑臺訓(xùn)練結(jié)束后，每組各3只老齡大鼠處死用以獲得肌腱干細胞并首先用以比較肌腱干細胞各種特性。每組剩下6只老齡大鼠被用以制作髕腱缺損模型，并分別在模型制作結(jié)束后第4周和第8周處死老齡大鼠用以評價肌腱缺損愈合情況。
　　結(jié)果：
　　1.老齡化肌腱干細胞的特征。
　　我們首先對老齡化肌腱干細胞進行了干細胞表面標(biāo)記流式分析和核內(nèi)標(biāo)記的免疫熒光染色鑒定。結(jié)果顯示:老齡化髕腱來源肌腱干細胞表面標(biāo)記物CD90、Stro-1和

5、SSEA-1表達陽性;而CD34、CD45、CD44、CD31表達陰性。老齡化髕腱來源肌腱干細胞核內(nèi)干細胞標(biāo)記物OCT-4、NS和Nanog表達陽性。
　　2.老齡化弱化了大鼠髕腱來源肌腱干細胞的增殖和自我更新能力。
　　孵箱孵育10-16天后，倒置光顯微鏡下分別可見老齡大鼠和成年大鼠肌腱干細胞克隆。老齡大鼠髕腱克隆來源的肌腱干細胞P0形態(tài)不均一，肌腱干細胞向心性較弱，細胞核渾濁不明顯;而成年大鼠髕腱來源的肌腱干細胞P0形態(tài)

6、均一，多呈四邊形;細胞呈中央向心性排列。與成年大鼠髕腱來源的肌腱干細胞P0相比，老齡大鼠老齡大鼠髕腱來源的肌腱干細胞P0細胞形態(tài)更加細長，多變而不均一，細胞核大而不明顯，排列更加紊亂。老齡大鼠和成年大鼠髕腱來源肌腱干細胞皆表達CD90，統(tǒng)計結(jié)果顯示成年大鼠髕腱來源肌腱干細胞CD90表達陽性率要高于老齡大鼠髕腱來源肌腱干細胞，兩者有顯著性差異。老齡大鼠和成年大鼠髕腱來源肌腱干細胞OCT-4，Nanog，NS免疫染色均陽性。老齡大鼠髕腱來源

7、肌腱干細胞的PDT為34.9±1.4h;而成年大鼠髕腱來源肌腱干細胞的PDT為23.9±0.8h，兩者具有顯著性差異(p＜0.01)。老齡大鼠和成年大鼠髕腱來源的肌腱干細胞孵育24小時的平均OD分別為:0.62±0.04;0.47±0.05;兩者具有顯著性差異(P=0.002);老齡大鼠和成年大鼠髕腱來源的肌腱干細胞孵育48小時的平均OD分別為:0.73±0.03，0.54±0.03，兩者具有顯著性差異(P=0.004)。老齡大鼠髕腱來

8、源肌腱干細胞P1 ColⅠ，LPL，ColⅡ和Osteocalcin表達分別為成年大鼠髕腱來源肌腱干細胞P1表達的0.4，2.1，1.5和5.6倍。
　　3.體外適度牽伸和適度跑臺訓(xùn)練增強老齡肌腱干細胞的克隆和增殖能力，并誘導(dǎo)老齡肌腱干細胞向肌腱細胞分化。
　　老齡大鼠髕腱來源的肌腱干細胞在4％機械牽伸后，其核內(nèi)干細胞表達標(biāo)記OCT-4，Nanog和NS表達增加;肌腱干細胞的增殖也顯著增加。老齡大鼠髕腱來源肌腱干細胞P1在4

9、％機械牽伸24小時后，RT-PCR結(jié)果顯示:COⅠⅠ，COLⅡ，LPL和Osteocalcin表達分別為未牽伸組的4.14倍，0.27倍，0.23倍，0.70倍。
　　適度跑臺訓(xùn)練組和籠中自由活動組老齡大鼠髕腱來源肌腱干細胞都能形成克隆，然而跑臺組老齡大鼠髕腱來源肌腱干細胞形成的克隆數(shù)目更多，直徑更大;而且肌腱干細胞的形態(tài)變得均一。適度跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠TSCs的增殖能力增加了31％(p＜0.01); OD值增加了10％(p=0.

10、04)。流式分析結(jié)果顯示:適度跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠肌腱干細胞SSEA-1和Stro-1陽性率分別為對照組的2.46倍和6.25倍。另外qRT-PCR結(jié)果顯示:適度跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠OCT-4和Nanog的表達分別為籠中自由活動組的4.17倍和3.23倍;而適度跑臺訓(xùn)練組組老齡大鼠肌腱干細胞ColⅠ，Sox-9，PPAR和Runx-2分別為對照組3.50倍，0.01倍，0.27倍和0.13倍，具有顯著性差異。
　　4.適度跑臺訓(xùn)練增強

11、了老齡大鼠肌腱愈合能力。
　　我們成功制備了跑臺訓(xùn)練組和籠中自由活動組老齡大鼠髕腱缺損模型。老齡大鼠髕腱缺損模型制作4周后，取髕腱組織并行HE染色，結(jié)果顯示:跑臺訓(xùn)練組和籠中自由活動組兩組老齡大鼠髕腱缺損模型都未完全愈合，而籠中自由活動組髕腱缺損較之跑臺訓(xùn)練組明顯。老齡大鼠髕腱缺損模型制作8周后，大體觀跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠的髕腱缺損已消失，而籠中自由活動組仍較明顯;髕腱組織HE染色結(jié)果顯示:跑臺訓(xùn)練組髕腱缺損已被較多增殖肌腱細胞填充

12、，且肌腱纖維排列較整齊;而籠中自由活動組原髕腱仍可見空白區(qū)以及排列紊亂的肌腱纖維。免疫組化結(jié)果證實跑臺訓(xùn)練組老齡大鼠的髕腱缺損區(qū)有較多新生的膠原組織。
　　結(jié)論：
　　老齡化髕腱來源肌腱干細胞的干性降低，并且其增殖能力，克隆能力都顯著下降;老齡化肌腱干細胞更易于向非肌腱細胞分化。體外適度牽伸和適度跑臺訓(xùn)練增強了老齡化肌腱干細胞的增殖能力，并促進老齡化肌腱干細胞向肌腱細胞分化，說明其可以有效對抗老齡化對肌腱干細胞的不利影響;適