牽伸載荷對大鼠跟腱微損傷的修復作用及其對TSCs立早基因的影響.pdf

1、肌腱微損傷是運動員和普通勞動者中廣泛存在的組織損傷，常發(fā)生于反復、過度拉伸肌腱之后，表現(xiàn)為肌腱局部疼痛、腫脹和運動功能受限，組織學表現(xiàn)為肌腱纖維紊亂、斷裂。肌腱微損傷不能有效修復被認為是誘發(fā)肌腱退變、肌腱病的主要原因。有報道顯示肩袖腱病在普通人中發(fā)病率為2.4～20％，跟腱病在高水平運動員中發(fā)病率高達52％，這對人們的日常生活和運動員的競技水平產(chǎn)生了嚴重的影響。因此，研究微損傷修復的影響因素，尋找促進微損傷修復方法是目前仍有待解決的問題

2、。
　　肌腱作為肌肉與骨之間的力學傳導組織，牽伸載荷對肌腱生理功能的維持起到重要作用。有學者認為，長期過度牽拉肌腱，使肌腱的損傷無法有效修復是導致肌腱病的重要原因。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，通過離心性牽伸訓練可以緩解甚至治愈肌腱病。由此可見，牽伸載荷如一柄雙刃劍，即可導致肌腱損傷，又能促進肌腱修復。所以，研究牽伸載荷對肌腱的作用機制，發(fā)揮其有利作用，避免其不利影響，是促進肌腱微損傷修復的可靠途徑。
　　目的:
　　1.探討不同

3、牽伸載荷條件對大鼠微損傷跟腱修復的影響，明確有利于肌腱修復的應力強度，闡明理想牽伸載荷對TSCs生物學特性的影響。
　　2.闡明牽伸載荷早期對TSCs立早基因表達的影響。
　　方法:
　　1.大鼠跟腱微損傷動物模型的建立
　　將6只8周齡雄性SD大鼠麻醉后，右側(cè)跟腱注射膠原酶溶液作為實驗組，左側(cè)跟腱注射PBS溶液作為對照組。注射1周后通過跟腱組織的大體表現(xiàn)、組織病理學表現(xiàn)和分化標志基因表達對比，判斷造模是否成功。

4、
　　2.牽伸載荷對大鼠跟腱微損傷修復的影響
　　將72只SD大鼠經(jīng)過適應性跑臺訓練后，跟腱注射Ⅰ型膠原酶溶液，制備跟腱微損傷大鼠模型。然后依據(jù)跑臺強度條件將大鼠隨機分為3組:對照組（籠中飼養(yǎng)）、低強度組(13m/min，20min/day)、高強度組(17m/min，1h/day)。在跑臺開始時、跑臺1周、跑臺4周時分別觀察大鼠跟腱的大體變化、組織病理學變化、生物力學變化以及成肌腱分化標志基因表達變化。觀察不同跑臺條件的牽

5、伸載荷強度對微損傷跟腱修復的影響，明確有利于跟腱修復的理想牽伸載荷強度和時間點。
　　然后利用該理想牽伸載荷強度和時間點，對9只8周齡SD雄性大鼠進行實驗干預，并分別將提取的TSCs標記位為:對照組（跟腱注射PBS溶液）、誘導組（跟腱注射Ⅰ型膠原酶溶液）、誘導+跑臺組（跟腱注射Ⅰ型膠原酶溶液+理想強度跑臺）。觀察干預對TSCs的生物學影響:結(jié)晶紫染色觀察集落數(shù)量;倒置相差顯微鏡觀察集落形態(tài);CCK8法觀察增殖能力;流式細胞學觀察細

6、胞凋亡和細胞表面標志物;免疫熒光觀察干性標志物;細胞學染色、RT-PCR觀察細胞分化能力變化。
　　3.體外牽伸載荷對大鼠跟腱來源TSCs立早基因表達的影響
　　沿用本課題組成熟的TSCs分離、培養(yǎng)、傳代技術，利用自制細胞單軸循環(huán)牽拉裝置在體外對細胞進行牽拉。分別用2％～12％的牽拉強度和不同牽拉時間對細胞進行分組，利用RT-PCR觀察細胞在牽拉早期c-fos基因、分化標志基因表達的特點。
　　結(jié)果:
　　1.Ⅰ

7、型膠原酶溶液誘導的大鼠跟腱組織與對照組相比，大體觀察表現(xiàn)為腱旁組織增多，肌腱黯淡缺乏光澤。組織學表現(xiàn)為異形細胞增多、膠原纖維排列紊亂、纖維損傷等。組織成肌腱標志基因(ColⅠ、TNMD)表達明顯減少(p＜0.05)，成骨分化標志基因(Runx2)表達增多(p＜0.05)。
　　2.對肌腱微損傷模型大鼠經(jīng)過1周的不同強度跑臺負荷刺激后，各實驗組大鼠的跟腱在大體觀察、組織病理學表現(xiàn)及生物力學表現(xiàn)等方面未觀察到明顯變化(p＞0.05)，

8、但低強度組跟腱的成肌腱分化標志基因(ColⅠ、TNMD)相對表達量較對照組和高強度組均升高(p＜0.05)。經(jīng)過4周跑臺牽伸載荷刺激后，各實驗組間出現(xiàn)明顯差異:大體觀察，低強度組腱旁增生組織較對照組和高強度組明顯減少;組織學觀察，低強度組組織學半定量評分顯著低于對照組和高強度組，而高強度組的組織學評分明顯高于對照組和低強度組(p＜0.05);生物力學測試，低強度組與對照組相比，最終應力與抗拉強度均明顯升高(p＜0.05);低強度組的組織

9、成肌腱標志基因ColⅠ較對照組和高強度組明顯升高(p＜0.05)，各組間TNMD基因相對表達量未見明顯差異(p＞0.05)。
　　3.誘導+跑臺組的TSCs細胞集落數(shù)較誘導組減少，集落中的細胞分部較誘導組更緊湊，CCK-8法檢測到24h和48h的誘導+跑臺組TSCs的OD值較誘導組增高(p＜0.05)。細胞凋亡實驗在各實驗組間無明顯差異。
　　誘導+跑臺組TSCs的細胞干性標記物Nanog較誘導組表達增多(p＜0.05)。誘

10、導+跑臺組TSCs的細胞標志物中CD44、CD73比例較對照組和誘導組升高。
　　誘導+跑臺組TSCs的成骨分化標志基因(Runx2、Dlx5)、成軟骨分化標志基因(ColⅡ)相對表達量較誘導組明顯減少(p＜0.05);而誘導+跑臺組成肌腱分化標志基因(ColⅠ、TNMD)、成脂分化標志基因(ap2、PPARγ)相對表達量較誘導組明顯增多(p＜0.05)。
　　經(jīng)過成骨誘導培養(yǎng)后，誘導+跑臺組的TSCs成骨分化標志基因(Ru

11、nx2、Dlx5)相對表達量較對照組和誘導組顯著升高(p＜0.05)，誘導組的Runx2相對表達量較對照組明顯降低(p＜0.05);經(jīng)過成脂肪誘導培養(yǎng)后，誘導+跑臺組TSCs的成脂肪分化標志基因（ap2、PPARγ）相對表達量較誘導組明顯升高(p＜0.05)，其中PPARγ相對表達量較對照組亦顯著升高(p＜0.05)，誘導組TSCs的PPARγ相對表達量較對照組顯著降低(p＜0.05);經(jīng)過成軟骨誘導培養(yǎng)后，誘導+跑臺組TSCs成軟骨分

12、化標志基因(ColⅡ、Sox9)的相對表達量較誘導組明顯降低(p＜0.05);而誘導組TSCs的ColⅡ、Sox9基因相對表達量較對照組、誘導+跑臺組均明顯上升(p＜0.05)
　　4.與對照組相比，TSCs在4％和8％牽拉強度下在單軸循環(huán)牽拉30min時c-fosmRNA相對表達量達到峰值(p＜0.05)。2％牽拉強度即可使TSCs的c-fos mRNA相對表達量升高(p＜0.05)，6％、8％、12％牽拉強度可使其相對表達量進

13、一步升高(p＜0.05)。時間方面，僅牽拉5min即可使c-fos相對表達量明顯升高(p＜0.05)。8％牽拉強度在120min時，ColⅠ、TNMD、Dlx5、Runx2等基因相對表達量均升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Ⅰ型膠原酶溶液注射入SD大鼠跟腱后能夠在大體和組織病理學表現(xiàn)上模擬肌腱微損傷表現(xiàn)，該模型是一種比較理想的動物模型。
　　2.不同強度牽伸載荷在1周對微損傷修復的影響無差異。低強度(13m/

14、min，20min/day)跑臺牽伸載荷4周能夠促進大鼠微損傷跟腱的修復;高強度(17m/min，1h/day)跑臺牽伸載荷4周阻礙微損傷肌腱的修復。因此對大鼠微損傷跟腱的修復來說，13m/min，20min/day跑臺4周是較為理想的牽伸載荷條件。
　　3.理想牽伸載荷條件對大鼠跟腱的TSCs影響主要表現(xiàn)在增殖能力強、集落形態(tài)集中、細胞干性增強、CD44和CD73表達增多、細胞向成肌腱和成脂肪方向分化等方面，說明牽伸載荷對TSC