丙戊酸對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種給個人、家庭及社會帶來巨大醫(yī)療、心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的突發(fā)性事件。大量的研究證明，成年哺乳動物只有外周神經(jīng)可以再生，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)不能再生。與外周神經(jīng)和胚胎CNS相比，損傷軸突不能再生的主要原因是：殘存成熟神經(jīng)元內(nèi)在的再生能力下降；CNS微環(huán)境中存在軸突生長抑制因子；膠質(zhì)細(xì)胞增生形成的瘢痕阻礙軸突生長。近年來研究證明，當(dāng)提供適當(dāng)

2、的條件后CNS能夠再生，而且這些軸突的再生是由中樞神經(jīng)元固有特性(intrinsic properties)和所處的環(huán)境決定的。然而許多措施雖然可以促進(jìn)軸突出芽，但由于膠質(zhì)細(xì)胞形成的膠質(zhì)瘢痕和抑制因子阻礙了神經(jīng)的生長，再生軸突中的大部分圍繞細(xì)胞或組織移植區(qū)生長，很少有神經(jīng)纖維跨越損傷區(qū)而進(jìn)入遠(yuǎn)端，要建立功能性軸突聯(lián)系更加困難。如果能夠應(yīng)用藥物進(jìn)行干預(yù)，將是一種簡單易行的方法。目前臨床應(yīng)用甲基強的松龍(mythylprednisolone

3、，MP)、治療性疫苗(therapeutic vaccination)等藥物來改變神經(jīng)元內(nèi)在的再生狀態(tài)，提高cAMP,失活Rho。有資料顯示，沒有足夠的證據(jù)表明MP對急性SCI有明顯的治療作用。在成年大鼠CNS的局部應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)能提高損傷神經(jīng)元存活和損傷軸突的生長，但NTF家族其分子量大，很難透過血腦屏障，并且經(jīng)過酶的降解作用使其對神經(jīng)元保護(hù)作用和軸突的生長作用大大受限。因此尋求一種能夠通過血腦屏障且不易降解、無毒、具有類

4、似NTF作用的藥物是非常重要的。 丙戊酸(valproic acid，VPA)是一種分子量很小的短鏈脂肪酸，具有迅速穿過BBB的特性。它作為抗癲癇和抗驚厥的一線藥物，已在臨床應(yīng)用近40年。最近的研究發(fā)現(xiàn)，VPA在大腦和體外細(xì)胞培養(yǎng)中具有保護(hù)、營養(yǎng)和抑制神經(jīng)元凋亡的作用；能夠?qū)怪嗵钱a(chǎn)生的神經(jīng)毒作用；使培養(yǎng)中的細(xì)胞內(nèi)氧化作用降低；降低炎癥因子的水平，保護(hù)多巴胺神經(jīng)元，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增生；能夠使哺乳動物神經(jīng)元生長錐

5、膨大，防止塌陷，從而促進(jìn)神經(jīng)生長；對損傷后的外周神經(jīng)有明顯促進(jìn)生長的作用，并加速其髓鞘化。促進(jìn)培養(yǎng)中的腦源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)向神經(jīng)元分化，對于大鼠NSCs培養(yǎng)分化后，其促進(jìn)神經(jīng)生長的效果優(yōu)于BDNF和NT3。 關(guān)于VPA對SCI的研究很少，它能否保護(hù)脊髓神經(jīng)元；促進(jìn)殘存神經(jīng)元軸突生長；抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生?本研究的目的是觀察VPA對大鼠SCI后的修復(fù)作用，并對其機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床SCI

6、提供治療策略，同時對SCI后呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥的原因進(jìn)行初步的探索。 主要方法及技術(shù)路線 實驗分為四個部分 1．采用孕13-16天的Wistar胎鼠脊髓組織，在體外用NB(Neural basal medium，NB)培養(yǎng)液進(jìn)行NSCs培養(yǎng)，采用Nestin進(jìn)行免疫熒光鑒定NSCs。在分化時加入含有濃度為1.0mM VPA的培養(yǎng)基，分化后用GFAP和NF-200進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)，觀察VPA對NSCs分化的影響。

7、 2．制備Wistar大鼠T10脊髓平面的Allen's打擊損傷模型，打擊力度為25 g·cm。實驗動物分為對照組(A組)；單純損傷組(B組)；損傷后MP治療組(C組)和損傷后VPA治療組(D組)；C組于損傷后半小時內(nèi)首次按30mg/kg，隨后按5.4mg/kg/h給予MP，每1小時給藥一次，連續(xù)給23次；D組于損傷后半小時經(jīng)腹腔按300mg/kg/d，分兩次給藥；B組同D組一樣每日給予等量的生理鹽水，觀察8w。采用BBB評分、神經(jīng)電

8、生理和BDA神經(jīng)順行示蹤技術(shù)，評價VPA對SCI后的神經(jīng)修復(fù)作用。 3．建立大鼠Allen's打擊損傷模型，將動物分為對照組(A組)、單純損傷組(B組)和VPA治療組(C組)。每個組又按不同時相點分為1d,3d,1w,2w,4w，通過病理學(xué)、TUNEL技術(shù)和電子顯微鏡觀察VPA對SCI后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用；應(yīng)用Nestin免疫組化染色，Brdu與NF-200免疫熒光雙標(biāo)，觀察VPA對內(nèi)源性NSCs的作用；采用Brdu免疫組化和G

9、FAP與NF-200免疫熒光雙標(biāo)，觀察VPA對神經(jīng)元的保護(hù)作用和對星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響； 4．制備Wistar大鼠T10脊髓平面的Allen's打擊損傷模型，打擊力度為25 g·cm。將動物分為對照組(A組)和實驗組(B組)。A組只切除椎板組，B組為SCI。每個組又按照不同時相點分為1d,3d,1w,2w,4w。取肺組織，通過大體標(biāo)本和病理學(xué)觀察SCI后肺組織形態(tài)學(xué)變化；并通過濕干重之比(W/D)測定肺組織水腫程度。

10、主要結(jié)果及結(jié)論： 1．在脊髓源性NSCs的培養(yǎng)中，加入含有濃度為1.0mM VPA的血清培養(yǎng)基2w，與對照組比較，分化成神經(jīng)元的數(shù)目明顯比對照組多(p<0.01)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例比對照組少(p<0.01)。表明VPA能夠促進(jìn)脊髓源性NSCs向神經(jīng)元分化，抑制NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。 2．大鼠SCI后，A組8w時BBB評分為21分；而B組8w時為17.46±1.98：C組為17.53±1.76；D組為19.87±

11、1.89(p<0.05)。8w時，B組MEP潛伏時為11.06±1.18；C組為10.88±1.42；而D組為8.90±0.80(p<0.05)。B組SEP潛伏時為15.75±1.04；C組為15.09±1.32；而D組為13.25±0.89(p<0.05)。BDA神經(jīng)示蹤顯示：8w時DBA標(biāo)記到的皮質(zhì)脊髓束A組為32.23±3.21；B組為17.52±3.98：C組為18.09±4.21；D組為25.26±4.84(p<0.05)。上

12、述結(jié)果表明VPA對大鼠SCI后的神經(jīng)修復(fù)有一定的促進(jìn)作用。而MP對大鼠SCI后的功能恢復(fù)沒有明顯作用(p>0.05)。 3．大鼠SCI后3d，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰，C組凋亡指數(shù)為25.24±4.05；B組凋亡指數(shù)38.21±4.55；明顯高于C組(p<0.05)，隨后開始下降。電子顯微鏡掃描結(jié)果顯示：神經(jīng)元胞核染色質(zhì)邊集，胞核增大，出現(xiàn)凋亡小體的細(xì)胞在B組較C組多。結(jié)果表明：VPA能夠抑制神經(jīng)元凋亡，這可能是SCI后V

13、PA促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的主要原因之一。 4．大鼠SCI后24h，B組Nestin表達(dá)與C組無顯著差異；1w時C組在中央管周圍Nestin陽性細(xì)胞明顯較B組多(p<0.05)，持續(xù)至4w時仍高表達(dá)。B組4w時Nestin表達(dá)明顯下降，8w時很少或幾乎無表達(dá)(p<0.05)。中央管周圍許多Nestin陽性表達(dá)的細(xì)胞證明：大鼠SCI后，損傷啟動某些細(xì)胞表達(dá)Nestin。Brdu與NF-200免疫熒光雙標(biāo)顯示：中央管周圍發(fā)現(xiàn)Brdu與NF

14、-200共表達(dá)的陽性細(xì)胞證明，SCI能夠誘導(dǎo)脊髓發(fā)育和再生。結(jié)果表明：SCI能夠激活內(nèi)源性NSCs，而VPA能夠進(jìn)一步促進(jìn)NSCs的增殖，并可能促進(jìn)其向神經(jīng)元分化。這可能是VPA促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的另一個原因。 5．大鼠SCI后3d，C組和B組灰質(zhì)中Brdu陽性細(xì)胞都增多，但B組較C組明顯多。1w時陽性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，B組多于c組(p<0.05)。4w時兩組陽性數(shù)目都很少，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(p>0.05)。4w時GFAP與N

15、F-200免疫熒光雙標(biāo)顯示，B組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，后角幾乎沒有。星形膠質(zhì)細(xì)胞很多，且雜亂排列。C組神經(jīng)神經(jīng)元數(shù)目較B組多(p<0.05)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目相對較少(p<0.05)。結(jié)果表明：大鼠SCI后，VPA能夠抑制損傷脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，減輕膠質(zhì)瘢痕的增生。為再生軸突的穿越奠定了基礎(chǔ)。 6．大鼠SCI后，大體標(biāo)本觀察到，12h肺部出現(xiàn)出血和水腫，3d最為嚴(yán)重，1w開始緩解，4w基本恢復(fù)正常。鏡下：實驗組于6h出現(xiàn)散在肺