Sirt1與PGE2調(diào)控TSCs異常分化的機(jī)制研究.pdf

1、肌腱病在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中是一種高發(fā)病，目前臨床普遍采取抗炎治療，通過減少炎性因子PGE2達(dá)到減輕肌腱及腱周疼痛的目的。近年來自體肌腱干細(xì)胞治療自體肌腱病逐漸成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)醫(yī)生關(guān)注的重點(diǎn)。肌腱干細(xì)胞具有多項(xiàng)分化潛能，可以正常分化成肌腱，也可以異常分化成骨、成脂，如何調(diào)控其異常分化是肌腱病早期康復(fù)的關(guān)鍵。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，Sirt1是骨系及脂系分化的重要因子，因此，本課題研究炎性因子PGE2刺激下導(dǎo)致的肌腱病通過sirt1的調(diào)控抑制成脂和成骨促

2、進(jìn)成肌腱來達(dá)到治療肌腱病的目的，為臨床提供治療肌腱病的新方法。
　　目的：
　　本研究主要在前期工作的基礎(chǔ)上，檢測(cè)PGE2處理前后的肌腱干細(xì)胞其成骨分化能力的改變，并探求其相關(guān)的信號(hào)通路;構(gòu)建BMP-2，IGF-1，CEBPδ，CREBand Smad1穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞模型，探討PGE2處理前后的肌腱干細(xì)胞其成脂分化能力的改變，及其可能影響成脂分化的相關(guān)信號(hào)通路;從基因和蛋白水平檢測(cè)sirt1激活劑和抑制劑處理不同時(shí)間后肌腱

3、干細(xì)胞中sirt1的表達(dá)情況，并檢測(cè)處理前后細(xì)胞中成骨和成脂的變化，研究sirt1對(duì)肌腱干細(xì)胞成骨和成脂分化的調(diào)控，從而闡明其機(jī)制，為肌腱病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及生物學(xué)治療提供理論依據(jù)，最終達(dá)到治療肌腱病的目的。
　　方法：
　　第一部分:分離培養(yǎng)大鼠的肌腱干細(xì)胞，并用細(xì)胞免疫熒光的方法鑒定肌腱干細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白的表達(dá);分別用不同濃度的PGE2處理肌腱干細(xì)胞7天或者用100ng/ml的PGE2分別作用1天、3天、7天、

4、14天時(shí)，茜素紅染色、堿性磷酸酶染色以及油紅染色檢測(cè)處理前后肌腱干細(xì)胞中成骨、成脂能力的變化，并通過ELISA方法、Real time PCR、Western Blot從基因和蛋白水平檢測(cè)處理前后細(xì)胞中BMP2以及成脂基因PPARγ的表達(dá);不同濃度的PGE2處理大鼠肌腱干細(xì)胞7天誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞的成脂分化，分別用實(shí)時(shí)定量PCR方法和ELISA從基因和蛋白水平檢測(cè)肌腱干細(xì)胞中IGF-1的表達(dá)。在PGE2處理的肌腱干細(xì)胞組中加入MEK的抑制劑

5、U0126(10um)、PI3K的抑制劑LY294002(20um)以及Akt抑制劑Ⅳ(10um)，通過免疫印跡的方法分別檢測(cè)處理前后肌腱干細(xì)胞中磷酸化的Erk和磷酸化的Akt的表達(dá)水平。在肌腱干細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入BMP2(200ng/ml)，分別作用1天、3天、7天和14天后，茜素紅和堿性磷酸酶檢測(cè)肌腱干細(xì)胞的成骨能力。分別構(gòu)建BMP-2，IGF-1，CEBPδ，CREBand Smad1穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系，檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染前后及PGE2

6、處理前后BMP-2，IGF-1，CAMP，PKA，CEBPδ，Smad1的表達(dá)。
　　第二部分:分別檢測(cè)不同濃度的PGE2刺激肌腱干細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞中sirt1的表達(dá)。并分別用0.2um和0.4um的sirt1的激活劑SRT1720處理肌腱干細(xì)胞后，從基因和蛋白水平檢測(cè)肌腱干細(xì)胞中sirt1的表達(dá)量，同時(shí)用0.4um的sirt1的激活劑和0.2um的sirt1的抑制劑分別處理3天、7天、10天、14天后，從基因和蛋白水平檢測(cè)肌

7、腱干細(xì)胞中sirt1的表達(dá)量以及成骨相關(guān)指標(biāo)BMP2、Runx2和成脂相關(guān)指標(biāo)PPARγ的表達(dá)，茜素紅和油紅染色檢測(cè)細(xì)胞成骨成脂分化能力的變化。分別用0.4um的sirt1的激活劑SRT1720和0.02um的sirt1的抑制劑EX527處理肌腱干細(xì)胞，從基因和蛋白水平檢測(cè)肌腱干細(xì)胞中成骨相關(guān)通路SIRT1/β-catenin/ Runx2以及成脂相關(guān)通路PI3K/AKT/CEBPα/PPARγ的變化。將100ng/ml的PGE2注射到

8、大鼠跟腱腱鞘內(nèi)，處理4周，構(gòu)建大鼠肌腱病模型。用0.4um的sirt1激活劑SRT1720處理大鼠左側(cè)跟腱，10天后，HE染色觀察大鼠跟腱組織成骨成脂分化情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分:隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，肌腱干細(xì)胞的成骨能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)處理14天時(shí)，肌腱干細(xì)胞的成骨能力最強(qiáng)，同時(shí)BMP2激活了下游信號(hào)通路Smad1，5，8的磷酸化。PI3K的抑制劑LY294002以及Akt抑制劑Ⅳ不能抑制由BMP2激活的Smad的磷酸化

9、，卻可以減低Runx2的表達(dá)并抑制肌腱干細(xì)胞的成骨分化能力，MEK的抑制劑U0126無上述功能。PI3K/Akt信號(hào)通路參與到BMP2誘導(dǎo)的肌腱干細(xì)胞的成骨分化。隨著PGE2處理時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的不斷增高，肌腱干細(xì)胞的成脂分化能力逐漸增強(qiáng)，成脂基因PPARγ的表達(dá)也逐漸增高。PGE2促進(jìn)了肌腱干細(xì)胞的成脂分化。不同濃度的BMP2處理大鼠肌腱干細(xì)胞7天或者是用100ng/ml的PGE2分別處理細(xì)胞3天、7天、10天后，我們發(fā)現(xiàn)BMP2

10、單獨(dú)存在時(shí)不能直接介導(dǎo)PGE2誘導(dǎo)的成脂分化。隨著PGE2濃度的增加，處理時(shí)間的延長(zhǎng)，肌腱干細(xì)胞中IGF-1的表達(dá)逐漸增高。IGF-1與PGE2之間存在著時(shí)間依賴關(guān)系和劑量依賴關(guān)系。當(dāng)沒有BMP2存在，僅僅是IGF-1單獨(dú)作用，不能介導(dǎo)PGE2誘導(dǎo)的成脂分化。然而，BMP2和IGF-1共同存在時(shí)能夠介導(dǎo)PGE2誘導(dǎo)的成脂分化。PGE2或者是IGF-1+BMP-2處理細(xì)胞后，細(xì)胞中的Smad和CREB被激活，發(fā)生了磷酸化。PGE2或者是I

11、GF-1，而不是BMP-2，促進(jìn)了CREB的磷酸化，當(dāng)CREB的基因被干擾后，細(xì)胞中的IGF-1的表達(dá)下調(diào)。
　　第二部分:100ng/ml的PGE2分別作用1天、3天、7天、10天發(fā)現(xiàn)，肌腱干細(xì)胞中有sirt1的表達(dá)，且sirt1的表達(dá)量隨著PGE2濃度的增高而增高，隨著PGE2處理時(shí)間的延長(zhǎng)而延長(zhǎng)。且隨著sirt1的激活劑SRT1720濃度的增加，不管是基因水平還是蛋白水平，細(xì)胞中sirt1的表達(dá)增加，處理14天時(shí)，表達(dá)最高;

12、細(xì)胞中成骨指標(biāo)BMP2.Runx2的表達(dá)逐漸增高，成骨能力逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞中成骨相關(guān)通路β-catenin.Runx2的表達(dá)逐漸增高，第10天時(shí)最高，隨后，表達(dá)逐漸減低;而成脂相關(guān)指標(biāo)PPARγ的表達(dá)逐漸降低，成脂能力逐漸減弱，成脂相關(guān)通路PI3K/AKT/CEBPα/PPARγ的表達(dá)逐漸降低，第10天時(shí)最低，隨后，表達(dá)逐漸升高。同樣的，隨著sirt1的抑制劑EX527濃度的增高處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中sirt1的表達(dá)降低，第14天時(shí)，表達(dá)

13、最低;細(xì)胞中成骨指標(biāo)BMP2、Runx2的表達(dá)逐漸降低，第10天時(shí)最低，隨后，表達(dá)逐漸升高;而成脂相關(guān)指標(biāo)PPARγ的表達(dá)逐漸升高，第10天時(shí)最高，隨后，表達(dá)逐漸減低。100ng/ml的PGE2注射到大鼠跟腱腱鞘內(nèi)，處理4周，HE染色觀察到肌腱及腱周出現(xiàn)異位骨化和脂肪小滴的形成，證明本課題組成功構(gòu)建了大鼠肌腱病模型。當(dāng)0.4um的sirt1激活劑SRT1720處理大鼠左側(cè)跟腱，觀察10天后，HE染色顯示肌腱病的病理情況得到明顯改善。

14、r>　　結(jié)論：
　　第一部分:PGE2通過PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)了肌腱干細(xì)胞的成骨分化。IGF-1和BMP2共同作用促進(jìn)了了PGE2介導(dǎo)的TSCs的成脂分化。IGF-1和BMP2分別激活了下游的CREB和Smad的磷酸化，從而進(jìn)一步使成脂基因PPARγ2的表達(dá)上調(diào)，最終促進(jìn)了肌腱干細(xì)胞的成脂分化。
　　第二部分:肌腱干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了sirt1的表達(dá)，且Sirt1通過SIRT1/β-catenin/Runx2通路影響了肌腱