SIRT1在調(diào)控腸上皮屏障損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　腸粘膜屏障是機(jī)體抵御外界病原侵襲的重要屏障結(jié)構(gòu),包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障。腸黏膜機(jī)械屏障是由不斷的更新的上皮細(xì)胞以及細(xì)胞之間的緊密連接構(gòu)成的物理屏障,將上皮下的組織和腸道菌群隔離開(kāi),防止細(xì)菌的侵襲及隨后引起的炎癥,因此機(jī)械屏障是腸粘膜屏障結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。上皮細(xì)胞快速的更新,替代脫落的腸上皮細(xì)胞,維持著腸上皮屏障的完整性[1]。腸黏膜具有獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu),從血管、上皮下組織、腸粘膜上皮細(xì)胞到腸腔形成了明

2、顯的由高到低的氧濃度梯度[2]。炎癥性腸病(IBD)、全胃腸外營(yíng)養(yǎng)(TPN)、缺血再灌注(I/R)、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷和手術(shù)應(yīng)激等病理?xiàng)l件下,均可引起腸黏膜局部缺血缺氧,進(jìn)而破壞緊密連接蛋白及釋放大量炎性因子,導(dǎo)致腸道通透性增加,內(nèi)毒素入血及細(xì)菌移位(bacteria translocation,BT),進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),并最終誘發(fā)多臟器功能衰竭(MODS),甚至導(dǎo)致患者死亡[3]。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIR

3、T1)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC),在維持穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞生存中起關(guān)鍵作用[4]。SIRT1是第III類組蛋白去乙酰化酶sirtuin蛋白家族中的一員[5]。位于細(xì)胞核中的SIRT1蛋白是研究的最多的去乙?；?負(fù)性調(diào)節(jié)損傷反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和p53,從而促進(jìn)細(xì)胞在壓力下生存[6][7][8]。研究發(fā)現(xiàn),缺血缺氧等應(yīng)急情況下,SIRT1的激動(dòng)劑Resveratrol

4、的預(yù)處理可使心臟、腦及腎臟等組織器官損傷減輕[9][10][11]。大量研究證明,SIRT1在慢性炎癥性損傷過(guò)程中,通過(guò)減少炎性因子的釋放,以及抑制炎性因子介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng),發(fā)揮著保護(hù)作用[1][2][3]。Singh等[4]發(fā)現(xiàn),在葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎模型中,Resveratrol可以降低IL-6和IL-1β等炎癥因子表達(dá),減輕炎癥對(duì)腸黏膜造成的損傷。
　　對(duì)于SIRT1的在急、慢性病理?xiàng)l件中如何參與調(diào)控腸粘膜屏障功能

5、的研究,目前仍不明確。因此,本課題擬建立體外腸上皮屏障模型,應(yīng)用RT-PCR、蛋白印跡、免疫熒光、跨上皮電阻測(cè)定等技術(shù),探討缺氧條件以及TNF-α條件下SIRT1的激活對(duì)維持腸上皮屏障功能關(guān)鍵的分子Claudin-1、Occludin、ZO-1等的表達(dá)及結(jié)構(gòu)的變化。并通過(guò)跨上皮電阻技術(shù)測(cè)定跨上皮電阻(TER),明確缺氧條件下SIRT1的激活對(duì)腸上皮屏障的調(diào)控機(jī)制,為腸上皮屏障損傷及修復(fù)機(jī)制研究的提供新思路。
　　方法:
　　

6、1.體外建立腸上皮細(xì)胞缺氧模型及SIRT1激動(dòng)劑Resveratrol處理模型,通過(guò)跨上皮電阻(TER)測(cè)定技術(shù),了解缺氧及Resveratrol(SIRT1激動(dòng)劑)干預(yù)情況下TER的變化情況。通過(guò)蛋白印跡、RT-PCR、免疫熒光,檢測(cè)常氧、缺氧及缺氧條件下Resveratrol干預(yù)對(duì)腸上皮Claudin-1、Occludin、ZO-1表達(dá)以及結(jié)構(gòu)的影響。
　　2.在上述細(xì)胞模型中,通過(guò)蛋白印跡WB技術(shù)檢測(cè)NF-κB在各實(shí)驗(yàn)組的表

7、達(dá)變化,探討SIRT1在缺氧條件下腸上皮屏障功能調(diào)節(jié)可能的作用機(jī)制及信號(hào)通路。
　　3.模型建立腸上皮細(xì)胞系Caco-2 TNF-α處理及SIRT1激動(dòng)劑Resveratrol干預(yù)模型,通過(guò)transwell小室培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞、TER測(cè)定技術(shù),了解TNF-α處理及Resveratrol(SIRT1激動(dòng)劑)干預(yù)情況下TER的變化情況。通過(guò)蛋白印跡、免疫熒光,檢測(cè)對(duì)照、TNF-α處理及TNF-α處理+Resveratrol干預(yù)對(duì)腸上皮

8、Occludin、ZO-1表達(dá)以及結(jié)構(gòu)的影響。
　　主要結(jié)果:
　　1.單純?nèi)毖蹩梢詫?dǎo)致體外培養(yǎng)腸上皮Caco-2細(xì)胞SIRT1表達(dá)量減少;缺氧引起緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降,并且緊密連接結(jié)構(gòu)破壞,同時(shí)上皮細(xì)胞TER明顯降低;而SIRT1激動(dòng)劑Resveratrol緩解了缺氧條件引起的腸上皮屏障功能損害,腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)增多,且促進(jìn)跨上皮電阻TER恢復(fù)。<

9、br>　　2.缺氧6h后,Caco-2腸上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的p-IκB表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加,而I-κB則減少;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的p65表達(dá)明顯降低,同時(shí)細(xì)胞核內(nèi)的p65表達(dá)明顯增加。這表明p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核,是NF-κB活化的表現(xiàn),而SIRT1被Resveratrol激活后則能明顯抑制這一活化作用。
　　3.TNF-α處理可以導(dǎo)致體外培養(yǎng)腸上皮Caco-2細(xì)胞SIRT1表達(dá)量減少;TNF-α處理引起緊密連接蛋白Occludin和Z

10、O-1蛋白表達(dá)水平下降,并且緊密連接結(jié)構(gòu)破壞,同時(shí)上皮細(xì)胞TER明顯降低;而SIRT1激動(dòng)劑Resveratrol預(yù)處理緩解了TNF-α處理引起的腸上皮屏障功能損害,腸上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)增多,且促進(jìn)了跨上皮電阻恢復(fù)。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧及TNF-α處理?xiàng)l件下腸上皮SIRT1表達(dá)明顯降低,TJs表達(dá)降低,結(jié)構(gòu)破壞,同時(shí)造成腸上皮細(xì)胞 TER降低。而Resveratrol的預(yù)處理則可緩解這一作用。提示缺氧及TNF-