SIRT1在細胞應激反應中的作用及其機制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 SIRT1去乙?；概c細胞的核仁應激反應
　　本研究的目包括以下兩方面:(1)明確核仁應激反應是否存在于血管細胞中，以及核仁應激反應是否對不同的刺激存在特異性;(2)探討SIRT1對細胞核仁應激的作用和機制，明確SIRT1-核仁應激途徑是否可以為SIRT1介導的不依賴乙酰化作用的P53穩(wěn)定性的調控機制提供一個合理的解釋。
　　一、血管細胞中的核仁應激反應
　　目的：

2、>　　1.研究不同應激刺激（ACTD，H2O2，熱休克，血清饑餓和氨基酸饑餓）對于Hela細胞核仁應激的影響。
　　2.研究在不同的應激刺激下血管細胞(HUVEC，HSMC)能否發(fā)生核仁應激。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng):Hela細胞用高糖DMEM（含10％胎牛血清+1％青霉素/鏈霉素）貼壁培養(yǎng)。
　　2.核仁應激反應檢測:用ACTD(5nM)刺激Hela細胞、HUVEC及HSMC6、12、24小時;用H2O2

3、刺激Hela細胞、HUVEC及HSMC，分別設計濃度梯度(0，10μM，30μM，60μM，100μM，300μM，600μM，1200μM)和時間梯度(0，2、4、8、12小時)，以確定應激反應最佳濃度和時間。
　　結果：
　　1.ACTD刺激能誘導Hela細胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應激反應。
　　2.H2O2刺激能誘導Hela細胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應激反應。
　　3.血清饑餓不影響Hela

4、細胞核仁形態(tài)，血清饑餓可以誘導HUVEC和HSMC發(fā)生核仁應激反應。
　　4.氨基酸饑餓能誘導Hela細胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應激反應。
　　5.熱休克能誘導Hela細胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應激反應。
　　6.ACTD和H2O2刺激都能降低Hela細胞pre-rRNA表達水平。
　　7.ACTD刺激促進Hela細胞P53蛋白的富集。
　　結論：
　　1.在應激刺激情況下血管細胞中(

5、HUVEC，HSMC)的確存在核仁應激的現(xiàn)象。
　　2.雖然不同細胞發(fā)生核仁應激的刺激條件可能存在差異，我們的結果支持核仁應激是細胞應激條件下的一個普遍反應，對不同刺激條件的特異性不明顯。
　　二、SIRT1對細胞核仁應激反應的作用
　　目的：
　　明確SIRT1能否影響不同刺激引起的核仁應激反應
　　方法：
　　1.為了闡明SIRT1能否干預核仁應激的發(fā)生，本研究采用了四種方法改變Hela細胞SIR

6、T1的水平。
　　2.蛋白印跡實驗Western blotting檢測:提取Hela細胞蛋白，檢測SIRT1蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.下調SIRT1的水平促進核仁應激的發(fā)生
　　2.上調SIRT1的水平抑制核仁應激的發(fā)生
　　結論：
　　SIRT1是核仁應激的負調控因子，抑制細胞核仁應激的發(fā)生。
　　三、SIRT1改善核仁應激反應的機制
　　目的:
　　1.探討SIRT1調

7、節(jié)核仁應激的生物學機制
　　2.研究SIRT1與核仁之間的關系，SIRT1與核仁蛋白NPM是否共定位
　　3.研究SIRT1是否去乙?；疦PM，探討SIRT1與核仁蛋白NPM的關系。
　　方法:
　　1.細胞核仁的分離與鑒定:SIRT1抑制劑EX-527處理24小時的Hela細胞經(jīng)低滲裂解分離細胞核，相差顯微鏡觀察下，密度梯度離心分離細胞核仁，westernblot檢測核仁marker-NPM，NS，F(xiàn)ibril

8、larin;核質marker-Histone H3;細胞質marker-GAPDH，以驗證提取核仁的純度。
　　2.分析SILAC-蛋白組學。
　　3.免疫共沉淀:Hela細胞轉染SIRT1-Flag質粒，提取蛋白，免疫共沉淀法檢測外源性的SIRT1與NPM是否結合。
　　4.Western Blot:標簽Flag，AC-lysine，β-Actin蛋白表達。Hela細胞EX-527處理24小時后，后提取蛋白，檢測NP

9、M，AC-lysine，β-Actin蛋白表達。
　　5.免疫熒光法觀察SIRT1在Hela細胞中的分布，檢測SIRT1與核仁蛋白NPM是否共定位。
　　6.為了研究SIRT1抑制核仁應激的作用是否依賴于它去乙酰化酶的活性，本研究采用了三種方法改變SIRT1的活性。
　　7.NPM-pGEX質粒的構建和轉化。
　　8.NPM-GST融合蛋白的大量表達和純化。
　　9.進行體外乙酰化和去乙?；瘜嶒?br>　　

10、結果:
　　1.SIRT1與核仁標記性蛋白NPM相結合。
　　2.SIRT1在提取的Hela細胞核仁中部分表達。
　　3.SIRT1抑制核仁應激的作用只部分依賴于它去乙酰化酶的活性。
　　4.SIRT1沒有顯著影響Hela細胞的NPM乙?；?。
　　5.SIRT1能上調NPM蛋白水平。
　　結論：
　　1.SIRT1在Hela細胞核仁中表達，與核仁蛋白NPM相結合
　　2.與NPM結合的是S

11、IRT1蛋白的中間段，不與NPM結合后，SIRT1喪失了對核仁的保護作用。
　　3.SIRT1抑制Hela細胞核仁應激只部分依賴于其去乙?；傅淖饔?。
　　4.SIRT1介導的NPM去乙酰化在抑制核仁應激反應中可能不起決定性作用。
　　四、SIRT1可能通過非去乙?；臋C制調節(jié)P53富集
　　目的:
　　1.研究SIRT1對核仁應激發(fā)生時P53表達的影響。
　　2.探討SIRT1影響細胞P53富集的機

12、制。
　　方法:
　　1.免疫熒光法檢測P53表達:PBS清洗細胞，冰甲醇4℃固定，1％BSA封閉，一抗（1％BSA配置）4℃孵育過夜，二抗（1％BSA配置）避光常溫孵育1小時，DAPI細胞核染色，抗熒光淬滅分片劑封片。
　　2.Western blot法檢測P53表達。
　　3.構建P53突變質粒。
　　結果:
　　Hela細胞核仁應激的發(fā)生早于P53的積累。
　　用ACTD刺激Hela細胞，

13、設計時間曲線0，2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小時，核仁應激最早發(fā)生在4小時，而Western blot顯示P53積累大約發(fā)生在22小時；免疫熒光和WB方法發(fā)現(xiàn)，ACTD刺激Hela細胞能引起P53蛋白水平增加，過表達SIRT1能明顯降低P53的富集；SIRT1能通過不依賴于去乙?；饔谜{節(jié)P53富集。
　　結論:
　　SIRT1抑制核仁應激引起的P53富集，這個過程可能不依賴于SIRT1去乙

14、?；饔?。
　　五、心血管疾病中的核仁應激現(xiàn)象
　　目的:
　　探討在心血管疾病的動物模型上是否存在核仁應激現(xiàn)象。
　　方法:
　　1.構建心肌肥厚動物模型。
　　2.心肌肥厚動物超聲心動圖檢測。
　　3.組織免疫熒光檢測。
　　結果:
　　壓力超負荷誘導心肌重構的發(fā)生和發(fā)展。
　　結論:
　　心肌肥厚失代償期的小鼠心肌發(fā)生核仁應激。
　　第二部分 SIRT1去乙酰

15、化酶在剪切力誘導的血管內皮細胞
　　目的：
　　1.研究剪切力對內皮細胞自噬反應的影響。
　　2.探討SIRT1在介導內皮細胞自噬反應中的作用及生物學機制。
　　方法：
　　1.構建體外剪切力模型。
　　2.檢測自噬功能。
　　3.免疫共沉淀法檢測層流處理后自噬相關蛋白ATG5、ATG7、FoxO的乙?；健?br>　　4.應用Amplex red熒光法檢測NADPH氧化酶抑制劑對層流處理后H

16、UVECROS水平的影響。
　　5.應用Caspase3/7試劑盒檢測在層流剪切力干預，或者應用各種自噬抑制劑時下HUVEC的凋亡情況。
　　6.構建帶有SIRT1熒光素酶報告基因的質粒，轉染HUVEC細胞，用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測層流后SIRT1基因啟動子的活性。
　　結果：
　　免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)生理狀況下的層流剪切力誘導促進自噬，而低剪切力和振蕩剪切力不促進自噬；時程分析和層流停止實驗證實，層流剪切力引起的

17、自噬反應并不是一個短暫的適應壓力反應，而是一個持續(xù)的生理作用；氨基酸饑餓引起HUVEC自噬反應的發(fā)生，類似層流剪切力引起的自噬，可以用作陽性對照；層流剪切力增加P62的轉錄，但沒有改變P62的蛋白水平；自噬抑制劑氯喹顯著增加HUVEC LC3的含量；自噬后期的抑制劑BafilomycinA1既能增加基礎狀況下HUVEC LC3的含量，又能增加層流剪切力后HUVEC LC3的含量；層流剪切力不改變HUVEC mTOR的磷酸化水平；層流剪切

18、力增強HUVEC基因啟動子的活性；SIRT1去乙酰化酶的活性在其調節(jié)細胞自噬的過程中起重要作用；層流剪切力內皮細胞自噬反應的調節(jié)是氧化還原依賴的；SIRT1依賴的FoxO1激活在層流剪切力介導的自噬調節(jié)中是至關重要的；層流剪切力降低自噬相關蛋白ATG5和ATG7的乙?；?；自噬反應對內皮細胞有保護作用。
　　結論:
　　層流剪切力通過氧化還原反應和依賴SIRT1的機制促進內皮細胞自噬。內皮細胞中剪切力誘導的自噬可能是層流血