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文檔簡介
1、Sirt1是酵母染色質(zhì)沉默因子(Silent information regulator 2,Sir2)的哺乳動物同源體,屬于Ⅲ類組蛋白去乙?;?。Ⅲ類組蛋白去乙?;竻⑴c的反應(yīng)依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamid adenine dinucleotide),這不同于Ⅰ類和Ⅱ類組蛋白去乙?;?。Sir2家族的蛋白從細(xì)菌到人類都具有高度保守性,人Sirtuins是與Sir2具有同源性的一個(gè)家族,其中Sirt1是與Sir2同源
2、性最高的一個(gè)成員,在許多生命過程,如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、重組、長壽和基因沉默中都發(fā)揮了重要的作用。近年來的研究表明,Sirt1不僅可以去乙?;M蛋白如組蛋白H3、H4等,而且與很多轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子相互作用,調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄激活作用。這些轉(zhuǎn)錄因子包括:p53、FOXO家族、NF-κB(p65)、MyoD等;轉(zhuǎn)錄輔因子包括:NcoR、p300、PGC-1α等。
原癌蛋白c-Myc/Max復(fù)合物是由結(jié)構(gòu)功能相關(guān)
3、的亞家族亞單位組成的二聚體。這些成員均有進(jìn)化保守的亮氨酸拉鏈(leucirie zipper)又稱堿性拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域。c-Myc/Max復(fù)合物對細(xì)胞增殖、凋亡、代謝、腫瘤發(fā)生等生理或病理信號發(fā)生應(yīng)答,通過bZIP結(jié)構(gòu)域的堿性區(qū)域與DNA序列結(jié)合,調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。c-Myc的活性調(diào)節(jié)是通過多方面來完成的,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯后修飾、c-Myc/Max復(fù)合物的二聚化及和其他輔助蛋白的相互作用調(diào)節(jié)。Sirt1與c-Myc間的相互作用可能
4、為揭示Sirt1在腫瘤發(fā)生過程中的作用提供線索。
我們通過生物信息學(xué)的方法分析到在Sirt1的啟動子區(qū)有c-Myc的結(jié)合位點(diǎn)。通過在p53缺失的K562、H1299和p53突變的MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)c-Myc,檢測到Sirt1 mRNA和蛋白水平的上調(diào),ChIP的方法鑒定了c-Myc在Sirt1啟動子區(qū)的結(jié)合,而在p53表達(dá)的HeLa和293A中未檢測到c-Myc對Sirt1的上調(diào)和c-Myc在Sirt啟動子區(qū)
5、的結(jié)合。然后我們通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和EMSA確定了c-Myc結(jié)合在Sirt1啟動子的E-box2區(qū)。
另一方面我們通過免疫共沉淀和GST-pulldown的方法確定了Sirt1與c-Myc的相互作用及具體的介導(dǎo)相互作用的結(jié)構(gòu)域。同時(shí)通過IP和Western blot確定Sirt1作為去乙?;改軌蛞种芻-Myc的乙酰化水平。在HeLa和293A細(xì)胞中通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測了Sirt1的過表達(dá)在基礎(chǔ)水平能夠促進(jìn)c-My
6、c的轉(zhuǎn)錄活性。為了說明Sirt1是如何促進(jìn)c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性的,我們在K562中敲低Sirt1的表達(dá)量,檢測c-Myc的蛋白量,結(jié)果顯示Sirt1對c-Myc的蛋白量沒有明顯改變。在293A細(xì)胞中過表達(dá)Sirt1后也沒有檢測到外源過表達(dá)的c-Myc的蛋白量的改變,說明Sirt1對c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性的影響不通過影響其蛋白穩(wěn)定性。于是我們檢測了Sirt1是否影響c-Myc與Max二聚體的形成。通過Co-IP的方法發(fā)現(xiàn)Sirt1能夠增強(qiáng)c
7、-Myc與Max的結(jié)合。接著我們在K562、MDA-MB-231細(xì)胞中敲低Sirt1的量或過表達(dá)Sirt1,用Realtime-PCR的方法檢測到Sirt1能夠促進(jìn)c-Myc的下游靶基因hTERT、cyclinD2、LDHA的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)檢測到Sirt1干擾的K562細(xì)胞中c-Myc在hTERT的啟動子區(qū)的結(jié)合減弱,與Sirt1能夠增強(qiáng)c-Myc與Max的結(jié)合的結(jié)果一致。最后我們通過MTT和流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)Sirt1的干擾能夠抑制K562
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