創(chuàng)傷性腦損傷后Sirt1和MAPKs信號通路相互作用對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響.pdf

1、目的:星形膠質(zhì)細(xì)胞在創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic braininjury，TBI)后活化并變成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，它們合成的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein，GFAP)增多，通過用GFAP免疫組織化學(xué)方法在灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)可以看到星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大。星形膠質(zhì)細(xì)胞伸出突起，沿著損傷邊界朝著損傷部位遷移。當(dāng)這些突起遇到活化的炎性細(xì)胞和浸入的間質(zhì)細(xì)胞時(shí)，它們限制炎性區(qū)域，但并不能超過損害邊界。在損

2、傷周圍，它們分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子，用于形成基膜或重新構(gòu)成膠質(zhì)界膜。在遠(yuǎn)離軸突變性的區(qū)域也可有反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，它們與軸突、神經(jīng)元或小膠質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊可以成為觸發(fā)因子。
　　Sir2(Silent Information Regulator2)是sirtuin（SIRT）家族最早是1984年在酵母菌中作為一個(gè)可保持染色體沉默的高度保守基因組被發(fā)現(xiàn)的。已證實(shí)在酵母菌中Sir2

3、的過表達(dá)可以通過DNA的修復(fù)延長壽命。Sirtuins歸屬于組蛋白去乙?；?(histone deacetylase，HDAC)家族。SIRT1是哺乳動物Sir2的直系同源物，它是一個(gè)細(xì)胞核蛋白并且涉及調(diào)節(jié)許多細(xì)胞內(nèi)過程，包括凋亡、細(xì)胞衰老、內(nèi)分泌信號、糖穩(wěn)態(tài)、老齡化和長壽。在人類和嚙齒類動物中，七種結(jié)構(gòu)和功能不同的組蛋白去乙?；敢驯淮_定(SIRT1-SIRT7)。它們分別位于不同的亞細(xì)胞區(qū)，包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體等。SIRT1

4、去乙酰酶的活性是通過煙酰胺抑制和通過白藜蘆醇激活。此外，SIRT1蛋白活性可能是通過磷酸化作用調(diào)節(jié)，因?yàn)樵隗w外Ser27和Ser47位點(diǎn)可被磷酸化，然而，這些磷酸化位點(diǎn)的功能還沒有被確定。Sirt1可調(diào)節(jié)機(jī)體多種器官的壽命。Sirt1在胚胎腦組織中的表達(dá)水平特別高，在發(fā)育和成年哺乳動物腦組織中也有表達(dá)，提示sirt1對神經(jīng)元進(jìn)化有影響。Araki等證實(shí)，在小鼠神經(jīng)細(xì)胞中，Sirt1蛋白能延緩神經(jīng)細(xì)胞軸突降解，而這種降解往往發(fā)生于接觸化學(xué)

5、藥物或從細(xì)胞體斷離的神經(jīng)細(xì)胞軸突，表明Sirt1對神經(jīng)元也有保護(hù)作用。Sirt1通過對不同刺激的調(diào)節(jié)參與眾多病理過程，如老化、代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心血管功能障礙等，它主要存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，其激活狀態(tài)可導(dǎo)致其亞細(xì)胞定位的轉(zhuǎn)變，其中核質(zhì)穿梭非常。近期研究發(fā)現(xiàn)Sirt1是主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而磷酸化Sirt1(p-sirt1)僅局限于核，此外，DNA損傷引起的再分配使Sirt1離開DNA損傷位點(diǎn)的沉默序列和基因啟動子，進(jìn)而

6、改變在細(xì)胞內(nèi)的位置，這些變化可能在SIRT1的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
　　絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulatedkinase，ERK)，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38信號通路是MAPKs家族中的重要成員

7、。研究證實(shí)，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)（如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等）的過程中具有至關(guān)重要的作用。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1的去乙?；蚆APKs(ERK，JNK和p38)的磷酸化之間可以相互作用彼此影響，但具體機(jī)制尚未清楚，尤其是其在腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用機(jī)制更是研究甚少，因此，本課題就Sirt1和MAPKs信號通路之間相互作用對腦損傷后星形膠質(zhì)

8、細(xì)胞活化表達(dá)影響的機(jī)制進(jìn)行探究，為腦損傷后膠質(zhì)細(xì)胞過度活化導(dǎo)致的神經(jīng)損傷提供新的治療靶點(diǎn)。
　　研究方法:體外實(shí)驗(yàn):取出生1-3天的小鼠乳鼠大腦皮質(zhì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色GFAP蛋白表達(dá)對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度進(jìn)行鑒定。IL-1β刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，應(yīng)用Sirt1激動劑——白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，MAPK信號通路抑制劑U0126，SP600126和SB203580分別進(jìn)行干預(yù)，對照組為同劑量

9、濃度的抑制劑溶劑DMSO。免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測，western blot技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP, Sirt1，p-ERK，p-JNK和p-p38的蛋白表達(dá)，ELISA檢測活化后星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNFα的含量。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):制各小鼠黑質(zhì)紋狀體通路損傷模型，側(cè)腦室給予白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，MAPK信號通路抑制劑U0126，SP600126和SB20

10、3580進(jìn)行干預(yù)，對照組為同劑量濃度的溶劑DMSO。Western blot技術(shù)檢測損傷周圍組織GFAP, Sirt1和MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白p-ERK，p-JNK和p-p38的經(jīng)時(shí)活化表達(dá);免疫組織化學(xué)熒光雙重染色技術(shù)檢測損傷周圍Sirt1和MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白p-ERK，p-JNK和p-p38在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的活化表達(dá);ELISA檢測損傷周圍組織中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNFα的表達(dá)量;動物行為學(xué)如平衡木實(shí)驗(yàn)，抓力

11、測試，損傷后神經(jīng)功能評分等檢測損傷后給予白藜蘆醇，MAPK信號通路抑制劑U0126，SP600126和SB203580對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用Bonferroni檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn):1、western blot發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)明

12、顯增加，熒光染色顯示IL-1β刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP陽性表達(dá)增強(qiáng)且形態(tài)學(xué)有明顯改變，如胞體肥大，突起減少等符合反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的特征性改變。2、活化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)明顯減少，且p-ERK，p-JNK和p-p38蛋白表達(dá)水平明顯增高。3、應(yīng)用Sirt1激動劑——白藜蘆醇提高Sirt1表達(dá)，以及MAPKs信號通路抑制劑，可明顯降低星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP水平且胞體肥大、突起縮短變粗減少的細(xì)胞形態(tài)明顯改善。4、白藜

13、蘆醇可以提高p-ERK并抑制p-JNK和p-p38蛋白的表達(dá);抑制MAPKs信號通路活化后均可提高Sirt1蛋白的表達(dá)，且JNK信號通路抑制劑SP600125提高Sirt1蛋白表達(dá)的效果最為顯著。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):western blot結(jié)果顯示損傷后GFAP蛋白表達(dá)明顯增高，Sirt1蛋白表達(dá)減少，且ERK，JNK，p38信號通路均發(fā)生活化;熒光染色發(fā)現(xiàn)，損傷周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP陽性表達(dá)強(qiáng)烈，胞體肥大，突起縮短且減少并向損傷

14、區(qū)域聚集;白藜蘆醇可以提高Sirt1蛋白的表達(dá)，減弱損傷周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化并調(diào)節(jié)ERK，JNK和p38信號通路的活化表達(dá)，其中促進(jìn)ERK信號通路的活化但是抑制JNK和p38信號通路的活化;應(yīng)用MAPKs抑制劑后，在減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的同時(shí)可以提高Sirt1的表達(dá)，提示腦損傷后Sirt1和MAPKs信號通路活化具有一定的相互關(guān)聯(lián)，此結(jié)果與體外培養(yǎng)腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果一致;ELISA檢測結(jié)果顯示損傷后IL-1β，IL-6和TNFα表

15、達(dá)量明顯增加，應(yīng)用白藜蘆醇或者M(jìn)APKs信號通路抑制劑后IL-1β，IL-6和TNFα表達(dá)量明顯減少，提示提高Sirt1表達(dá)或者抑制MAPKs信號通路活化可以抑制損傷導(dǎo)致的炎癥因子表達(dá);動物行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，白藜蘆醇或者M(jìn)APKs信號通路抑制劑，均對損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論:1、IL-1β可刺激體外培養(yǎng)的腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。2、活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞Sirt1表達(dá)降低，ERK，JNK和p38信號通路發(fā)生