SIRT1通過(guò)調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白CRT參與脂質(zhì)代謝的機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　近年來(lái)國(guó)人飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變導(dǎo)致代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）和非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響國(guó)人健康。肝臟脂肪代謝紊亂是導(dǎo)致MS和NAFLD發(fā)生和發(fā)展的核心機(jī)制。因此，闡明肝臟脂肪代謝紊亂的病理機(jī)制和尋找干預(yù)靶點(diǎn)是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的重大難題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)去乙?；讣易遄钪匾某蓡T沉默

2、信息調(diào)節(jié)因子1（Silent information regulator1，SIRT1）在人肝臟脂肪變細(xì)胞中表達(dá)明顯下降，而SIRT1肝臟特異性敲除可引起明顯的肝臟脂肪變和糖異生障礙。以上結(jié)果提示SIRT1對(duì)肝臟糖脂代謝關(guān)鍵蛋白的去乙?；{(diào)控，并在脂質(zhì)代謝障礙中發(fā)揮尤為關(guān)鍵的作用。此外，SIRT1還可通過(guò)與眾多脂肪代謝的轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，如PPARγ、PGC-1α、FOXO等調(diào)控脂肪代謝。目前在能量代謝領(lǐng)域，對(duì)肝臟脂肪代謝通路及相關(guān)分

3、子的研究大多延續(xù)了30年前甚至更早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典分子，相關(guān)新分子發(fā)現(xiàn)及鑒定研究較為薄弱。在蛋白質(zhì)組學(xué)和功能基因組學(xué)日益成熟的今天，我們有條件和必要利用新的技術(shù)和手段探索肝臟脂肪代謝通路新的關(guān)鍵分子與通路。因此，本課題將聚焦 SIRT1與肝臟脂肪代謝的關(guān)系，旨在尋找能夠影響脂肪代謝的新的關(guān)鍵蛋白。我們的研究可能為MS及NAFLD的治療提供重要的理論和潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　1、構(gòu)建兩種不同的肝臟脂肪變小鼠模型：肝臟特異

4、性SIRT1敲除小鼠（SIRT1-LKO）和高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)小鼠。通過(guò)qPCR、Western-Blot、免疫組化、HE染色等方法確認(rèn)模型構(gòu)建。
　　2、將實(shí)驗(yàn)小鼠分為四組：CONTROL組，SIRT1-LKO組，HFD組，SIRT1-LKO＋HFD組。運(yùn)用iTRAQ-MS/MS和cDNA array技術(shù)分別篩選SIRT1相關(guān)差異蛋白和基因并鎖定興趣分子 CRT。qRT-PCR和Western-Blot進(jìn)行小鼠肝臟組織樣本中

5、CRT表達(dá)驗(yàn)證。
　　3、CRT功能驗(yàn)證。構(gòu)建CRT過(guò)表達(dá)及RNA干擾慢病毒載體，并分別轉(zhuǎn)入人胚胎肝細(xì)胞系（L02）及過(guò)表達(dá)SIRT1的L02細(xì)胞（L02-SIRT1）中。qRT-PCR和Western-Blot驗(yàn)證CRT表達(dá)情況。建立油酸（oleic acid，OA）和棕櫚酸（palmitic acid，PA）刺激細(xì)胞脂肪變模型。高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)檢測(cè) CRT的表達(dá)和脂肪合成的關(guān)系。qRT-PCR檢測(cè)CRT高、低表達(dá)L02細(xì)胞系中F

6、AS、SCD、ChREBP、PPARα等糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況。在同時(shí)過(guò)表達(dá)CRT和SIRT1的L02細(xì)胞（L02-SIRT1-CRT）中以免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）檢測(cè)SIRT1和CRT之間是否存在蛋白間相互作用。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建兩種不同的肝臟脂肪變小鼠模型。我們證實(shí)了SIRT1-LKO小鼠中SIRT1肝臟特異性缺如。HE染色顯示SIRT1-LKO小鼠和HFD

7、喂養(yǎng)小鼠均呈現(xiàn)肝臟組織明顯脂肪變。
　　2、通過(guò)iTRAQ-MS/MS技術(shù)和cDNA array篩選出興趣蛋白CRT，CRT的mRNA水平不變而蛋白水平升高提示其可能受到蛋白翻譯后修飾。iTRAQ結(jié)果顯示與CONTROL組相比CRT蛋白在SIRT1-LKO組及HFD組分別升高1.49和1.18倍，在SIRT1-LKO＋HFD組升高1.62倍。Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SIRT1-LKO組及HFD組小鼠肝臟組織中CRT蛋白水平

8、也升高，與iTRAQ結(jié)果相一致。cDNA array結(jié)果顯示CRT mRNA水平在SIRT1-LKO及HFD情況下均未發(fā)生明顯差異，qRT-PCR提示同一結(jié)果。
　　3、在CRT高、低表達(dá)的L02細(xì)胞系中驗(yàn)證CRT對(duì)脂肪合成的影響。構(gòu)建CRT過(guò)表達(dá)和RNA干擾慢病毒載體并經(jīng)雙酶切電泳及DNA測(cè)序驗(yàn)證。qRT-PCR和Western-Blot證實(shí)CRT過(guò)表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。油紅O和BODIPY染色證實(shí)OA和PA成功誘導(dǎo)脂肪變

9、細(xì)胞模型。高內(nèi)涵檢測(cè)提示CRT過(guò)表達(dá)能夠抑制脂肪合成，而CRT低表達(dá)使細(xì)胞中脂滴合成增加。qRT-PCR結(jié)果顯示FAS、ChREBP等促進(jìn)脂肪合成的基因在CRT高表達(dá)細(xì)胞系中降低，而在CRT低表達(dá)時(shí)升高。Co-IP結(jié)果提示SIRT1和CRT之間存在蛋白間相互作用。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建兩種不同的NAFLD小鼠模型。SIRT1-LKO小鼠呈現(xiàn)明顯的肝臟脂肪變，證實(shí)SIRT1可以抑制脂肪合成，與前期研究結(jié)果一致。