小檗堿通過(guò)Sirt1改善3T3-L1脂肪細(xì)胞糖代謝的機(jī)制研究.pdf

1、小檗堿(BBR)是常用清熱解毒藥黃連的主要活性成分，能顯著降低糖尿病患者和動(dòng)物血糖，減輕體重，改善糖耐量和胰島素抵抗。體內(nèi)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)是一種去乙酰化酶，在抗炎和調(diào)節(jié)敏感性脂肪組織糖脂代謝相關(guān)信號(hào)通路中與BBR作用靶點(diǎn)和生物學(xué)效應(yīng)基本一致。因此，本文以3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝紊亂為切入點(diǎn)，體外干擾Sirt1表達(dá)，探明BBR改善糖代謝是否依賴于Sirt1，為BBR的作用機(jī)制提供新的線索。
　　目的:
　

2、　體外培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞，探明小檗堿對(duì)脂肪細(xì)胞Sirt1蛋白表達(dá)和糖代謝及其相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響是否依賴于Sirt1的介導(dǎo)。
　　方法:
　　1) Western Blot和熒光定量PCR檢測(cè)不同濃度(1、5、10μMol/L)小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞中Sirt1表達(dá)的影響;2)將分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞用Sirt1抑制劑Ex527或慢病毒lv-Sirt1干擾Sirt1蛋白表達(dá)后分為四組，對(duì)照組，BBR組，

3、Ex527(或lv-Sirt1)組，Ex527(或lv-Sirt1)+BBR組，作用24h后更換含1nM胰島素和0.2％BSA的無(wú)酚紅低糖培養(yǎng)基作用10h，收取細(xì)胞上清液，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞的上清液中葡萄糖含量，以無(wú)酚紅高糖培養(yǎng)基中糖含量相減，即為各組細(xì)胞葡萄糖消耗量;3)按2)將分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞分為四組，提取蛋白采用Western Blot檢測(cè)脂肪細(xì)胞中LKB1ser428、AMPK-αThr172、ACCser

4、79的磷酸化蛋白表達(dá)，免疫沉淀檢測(cè)PGC-1α的乙?；磉_(dá);4)將誘導(dǎo)成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞分為六組，其中三組用Ex527預(yù)處理1h，同時(shí)加入TNF-α或合并加入5μMol/L BBR，分別為對(duì)照組，TNF-α組，TNF-α+BBR組，Ex527組，Ex527+TNF-α組，Ex527+TNF-α+BBR組，作用24后，棄上清，用含有1 nmol/L Insulin的0.2％BSA DMEM處理15min后加入30μM2-NBDG和

5、1μg/mlDAP2熒光探針的PBS37℃孵育2h，用高內(nèi)涵細(xì)胞成像儀拍照并計(jì)算脂肪細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度;5)按4)將誘導(dǎo)成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞分為六組，分別為對(duì)照組，TNF-α組，TNF-α+BBR組，Ex527組，Ex527+TNF-α組，Ex527+TNF-α+BBR組，作用24h，Western Blot檢測(cè)AKTser473與IRS-1 Y612磷酸化表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1)BBR可顯著上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞

6、中Sirt1蛋白和基因的表達(dá)，且5μMol/L BBR作用最為顯著(P＜0.05);2)BBR與正常組相比，BBR明顯增加葡萄糖消耗(P＜0.05)，但在Sirt1被Ex527抑制或被lv-Sirt1敲減后，BBR增加葡萄糖消耗這一作用明顯減弱;3) BBR明顯增加LKB1ser428、AMPK-αThr172、ACCser79的磷酸化表達(dá)，并降低PGC-1乙?；?，但在Sirt1被抑制或敲減后，BBR這一作用被減弱;4)與正常組比較

7、，TNF-α刺激后葡萄糖吸收減弱(P＜0.05)，BBR處理后，葡萄糖攝取增加50％(P＜0.05)，然而Sirt1被抑制后，BBR增加葡萄糖攝取作用減弱(P＜0.05);5)BBR有效恢復(fù)炎癥因子TNF-α抑制下AKTser473活性損傷，而Sirt1被抑制或敲減后，BBR恢復(fù)AKT活性的作用減弱，然而B(niǎo)BR對(duì)IRS-1 Y612的影響未見(jiàn)明顯變化。
　　結(jié)論:小檗堿依賴于Sirt1激活A(yù)MPK/AKT通路改善3T3-L1脂肪細(xì)