人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的代謝機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　 探討人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(globulardomainofadiponectin,gAd)促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖后,葡萄糖可能的代謝去路。
　　 方法
　　 培養(yǎng)并分化3T3-L1脂肪細(xì)胞,分化成熟后用油紅O染色法進(jìn)行脂質(zhì)鑒定；透析復(fù)性gAd,完成透析后以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。以含有不同濃度gAd(10ng／mL、50ng／mL、100ng／mL、300ng／mL、1000ng／mL)的

2、干預(yù)液干預(yù)分化成熟的3T3-LI脂肪細(xì)胞5h；收集干預(yù)液殘液以葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖濃度,并以實(shí)時(shí)熒光定量(realtimePCR,RT-PCR)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑關(guān)鍵酶己糖激酶(hexokinase,HK)、6-磷酸果糖激酶-1(6-phosphofructokinase—1,PFK—1)、丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PK)在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的變化,同時(shí)測(cè)定脂肪酸合成代謝關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoAca

3、rboxylase,ACC)、脂肪酸分解代謝關(guān)鍵酶肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(carnitinepalmitoyltransferaseⅠ,CPT-Ⅰ)、甘油三酯合成代謝關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(sn-glycerol-3-phosphateacyltransferase,GPAT)、磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6PD)在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的變化；以蛋白免疫印跡法(Westernblot)測(cè)

4、定PK和CPT-Ⅰ在翻譯水平表達(dá)的變化。用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±S.D)表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果
　　 1.gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖能力的影響
　　 各組細(xì)胞干預(yù)液殘液中葡萄糖濃度差異顯著(F=98.065,P=0.000)。其中,各實(shí)驗(yàn)組(gAd濃度依次為10、50、100、300、1000ng／mL)殘液中葡萄糖濃度均顯著低于對(duì)照

5、組(P均<0.01),且100ng／mLgad組較50ng／mLgAd組也降低(P<0.01)。進(jìn)一步對(duì)殘液中葡萄糖濃度降低程度與gAd濃度進(jìn)行相關(guān)性分析顯示,在相同作用時(shí)間內(nèi),隨著gAd濃度的增加葡萄糖濃度降低程度逐漸增加(r=0.699,F=10.721,P=0.005)。
　　 2.gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖酵解關(guān)鍵酶(HK、PFK-1、PK)表達(dá)的影響
　　 各組細(xì)胞HK轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異顯著(F=125

6、.789,P=0.000)。其中,各實(shí)驗(yàn)組(pAd濃度分別為10、50、100、300、1000ng／mL)表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著增加(P均<0.01),且高劑量實(shí)驗(yàn)組對(duì)HK表達(dá)的上調(diào)作用均顯著高于前一低劑量實(shí)驗(yàn)組(P均<0.05)。各組細(xì)胞PFK-1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異顯著(F=85.399,P=0.000)。其中10ng／mLgAd組表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)差別(P=0.295),其余各實(shí)驗(yàn)組(gAd濃度分別為50、100、300、100

7、0ng／mL)表達(dá)與對(duì)照組比較均顯著增加(P均<0.01),且50ng／mL、100ng／mL、300ng／mLgAd組對(duì)其表達(dá)的上調(diào)作用均顯著高于前一低劑量實(shí)驗(yàn)組(P均<0.05)。各組細(xì)胞PK在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異顯著(F=113.661,P=0.000)。其中,10ng／mLgAd組表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)差別(P=0.073),其余各實(shí)驗(yàn)組(gAd濃度分別為50、100、300、1000ng／mL)表達(dá)與對(duì)照組比較顯著增加(P均<0.0

8、1),且高劑量實(shí)驗(yàn)組對(duì)PK表達(dá)的上調(diào)作用均顯著高于前一低劑量實(shí)驗(yàn)組(P均<0.05)。由此可知,gAd對(duì)于HK、PFK-1、PK在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)均有上調(diào)作用。.同時(shí)Westernblot結(jié)果顯示,各組細(xì)胞PK在翻譯水平的表達(dá)同樣差異顯著(F=161.007,P=0.00),其中,50、100、300、1000ng／mLgAd組的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P均<0.01)。
　　 3.gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪代謝相關(guān)關(guān)鍵酶(G

9、PAT、ACC、CPT-1)表達(dá)的影響
　　 各組細(xì)胞GPAT在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)(對(duì)照組、10ng／mLgAd組、50ng／mLgAd組、100ng／mLgAd組、300ng／mLgAd組、1000ng／mLgAd組)無(wú)差別(F=1.400,P=0.292)；各組細(xì)胞ACC在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異顯著(F=32.546,P=0.000),其中,各實(shí)驗(yàn)組(gAd濃度分別為10、50、100、300、1000ng／mL)表達(dá)與對(duì)照組相比均

10、顯著增加(P均<0.05),且50ng／mLgAd實(shí)驗(yàn)組對(duì)其表達(dá)的上調(diào)作用顯著高于10ng／mLgAd實(shí)驗(yàn)組(P<0.05);各組細(xì)胞CPT-Ⅰ在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異顯著(F=381.854,P=0.000),其中各實(shí)驗(yàn)組(gAd濃度分別為10、50、100、300、1000ng／mL)表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P均<0.01),且高劑量實(shí)驗(yàn)組對(duì)其表達(dá)的上調(diào)作用均顯著高于前一低劑量實(shí)驗(yàn)組(P均<0.01)。該結(jié)果說(shuō)明,gad對(duì)3T3-L1脂肪

11、細(xì)胞內(nèi)GPAT在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)無(wú)影響,對(duì)ACC和CPT-Ⅰ在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)具有上調(diào)作用。同時(shí),Westernblot結(jié)果顯示,各組細(xì)胞CPT-Ⅰ在翻譯水平的表達(dá)同樣差異顯著(F=268.099,P=0.000),其中各實(shí)驗(yàn)組(gAd濃度分別為10、50、100、300、1000ng／mL)表達(dá)與對(duì)照組相比顯著增加(P均<0.01)。
　　 4.gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶(G6PD)表達(dá)的影響
　　 各

12、組細(xì)胞G6PD在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)(對(duì)照組、10ng／mLgAd組、50ng／mLgAd組、100ng／mLgAd組、300ng／mLgAd組、1000ng／mLgAd組)無(wú)差別(F=1.545,P=0.248)。
　　 結(jié)論
　　 1.本課題組制備的原核基因重組gAd可以促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞攝取胞外葡萄糖,說(shuō)明本課題組制備的原核基因重組gAd具有野生活性。
　　 2.gAd促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖的同