MGF E肽預(yù)處理對(duì)CoCl2誘導(dǎo)低氧下MSCs增殖、分化的影響.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其具有良好的自我更新與多向分化潛能，被廣泛用于細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)中?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究與臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， MSCs參與調(diào)控了骨修復(fù)過(guò)程并起到至關(guān)重要的作用，與血管生成、免疫調(diào)節(jié)及成骨分化等密切相關(guān)。骨再生過(guò)程中，MSCs能夠遷移到損傷位點(diǎn)，增殖并開(kāi)始向軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化，進(jìn)一步地分別介導(dǎo)軟骨內(nèi)和膜內(nèi)骨化。通常，MSCs在機(jī)體內(nèi)處于一種低氧微環(huán)境中(1％-7%pO2)，

2、甚至在骨缺損修復(fù)過(guò)程中將會(huì)承受更為嚴(yán)重的低氧應(yīng)激。之前的研究已經(jīng)表明，嚴(yán)重的低氧條件會(huì)顯著地抑制 MSCs的細(xì)胞活力、增殖以及成骨分化，這些均是目前階段亟需解決的問(wèn)題。多種生長(zhǎng)因子被證實(shí)在MSCs的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、增殖以及成骨成骨分化過(guò)程中具有良好的調(diào)控作用。其中，力生長(zhǎng)因子(mechano growth factor,MGF) E肽（下文中縮寫(xiě)為MGF）能夠有效地保護(hù)細(xì)胞或者組織免于低氧損傷。盡管如此，MGF是否能夠調(diào)控嚴(yán)重低氧環(huán)境條件下

3、MSCs的增殖和成骨分化仍是未知的。本文使用氯化鈷(CoCl2)模擬嚴(yán)重低氧環(huán)境，檢測(cè)嚴(yán)重低氧環(huán)境下MGF預(yù)處理對(duì)MSCs的細(xì)胞增殖與成骨分化的影響。本文主要內(nèi)容與相關(guān)結(jié)果如下：
　　(1)利用CoCl2模擬低氧環(huán)境條件并進(jìn)行低氧條件優(yōu)化選擇。
　　大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)CoCl2能夠有效模擬低氧微環(huán)境，其原理是鈷離子與亞鐵離子能夠在細(xì)胞中發(fā)生置換，并阻止低氧誘導(dǎo)因子?(hypoxia inducible factor1??,

4、HIF-1??的降解，從而間接地通過(guò)促進(jìn)HIF-1?積累模擬低氧。在本實(shí)驗(yàn)中，分別使用0、100、200、500、800和1000μM濃度的CoCl2處理MSCs細(xì)胞，24h后分別檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1?表達(dá)、細(xì)胞活力與細(xì)胞存活變化。結(jié)果表明，不同濃度的CoCl2均有效促進(jìn)HIF-1?表達(dá)，并有隨CoCl2濃度增加逐步上升的趨勢(shì)，證明成功地建立低氧模型。24h后，MSCs細(xì)胞活力分別被0、100、200、500、800、1000μM濃度的

5、CoCl2調(diào)節(jié)到116.85±2.23%、117.89±0.81%、69.03±1.92%、28.46±6.46%與11.55±1.99%。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CoCl2濃度超過(guò)500μM時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的死亡現(xiàn)象。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇500μM濃度CoCl2作為隨后實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件（對(duì)MSCs有害但非致死）。當(dāng)選擇500μM濃度CoCl2處理MSCs1、2、4、8、12及24h，MSCs細(xì)胞活力分別下降到92.83±2.58%、93.35±3

6、.42%、92.55±5.35%、90.85±4.13%、91.25±5.63%以及69.23±2.20%。因此，500μM濃度CoCl2培養(yǎng)24h后能夠顯著性地抑制MSCs細(xì)胞活力但不足以誘發(fā)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，能夠更適宜地模擬嚴(yán)重的低氧環(huán)境。
　　(2)嚴(yán)重低氧條件下MGF對(duì)MSCs增殖、凋亡、形態(tài)、粘附及遷移的影響。
　　本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的CoCl2(0,100,200,500,800,1000μM)處理MSCs2

7、4h后，快速地抑制了MGF mRNA表達(dá)，結(jié)果暗示了MGF參與低氧微環(huán)境對(duì) MSCs細(xì)胞生理生化調(diào)控的可能性。通過(guò)檢測(cè)MGF預(yù)處理后低氧對(duì)MSCs細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡、粘附與遷移的結(jié)果顯示，嚴(yán)重低氧條件下MSCs細(xì)胞面積收縮，圓度降低。同時(shí)，細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn)與transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞粘附與遷移能力被顯著地抑制，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)能力明顯不足。幸運(yùn)的是，MGF預(yù)處理改善了嚴(yán)重低氧條件下MSCs細(xì)胞活力，5、10、20、50及100ng/m

8、l濃度的MGF分別上調(diào)了嚴(yán)重低氧條件下MSCs的細(xì)胞活力53.07%、55.95%、71.23%、61.09%及58.90%，且與正常組相比無(wú)明顯差異。不僅如此，MGF預(yù)處理還降低了嚴(yán)重低氧條件下MSCs中HIF-1?的表達(dá)以及核轉(zhuǎn)移，細(xì)胞圓度及細(xì)胞面積均得到不同程度的恢復(fù)，并促進(jìn)了細(xì)胞粘附與遷移能力，同時(shí)對(duì)MSCs凋亡無(wú)任何影響，即不存在細(xì)胞毒性作用。
　　(3)MGF在嚴(yán)重低氧條件下對(duì)MSCs成骨分化的影響。
　　堿性磷

9、酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及茜素紅S染色分析用以檢測(cè)MGF對(duì)嚴(yán)重低氧條件下MSCs成骨分化的影響。參考之前的實(shí)驗(yàn)可知，ALP活性不僅能夠作為細(xì)胞多能性的指標(biāo)，同時(shí)也是干細(xì)胞早期成骨分化的重要參考，而茜素紅染色能夠直觀地觀察到細(xì)胞中鈣沉積現(xiàn)象。分析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嚴(yán)重的低氧顯著抑制了MSCs成骨分化，ALP活性與MSCs中鈣沉積均被明顯地抑制。但MGF預(yù)處理組與單獨(dú)CoCl2處理組相比成骨分化能力顯著恢

10、復(fù)，ALP活性及鈣沉積均得到明顯提升。分別于成骨分化第0、7及14天時(shí)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記基因ALP、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor2,Runx2)及骨鈣素(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重低氧條件下成骨分化相關(guān)的基因表達(dá)在不同時(shí)間均受到抑制，但經(jīng)MGF預(yù)處理后在第7與14天時(shí)得到有

11、效恢復(fù)。進(jìn)一步地，我們檢測(cè)了MGF預(yù)處理對(duì)輕度低氧100μM濃度CoCl2條件下MSCs成骨分化的影響，結(jié)果趨勢(shì)與500μM濃度CoCl2條件下一致，圖片結(jié)果顯示更為明顯。有趣的是，本文研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的MGF處理同樣促進(jìn)了MSCs的成骨分化能力，與之前的研究結(jié)論并不一致。分析發(fā)現(xiàn)本文實(shí)驗(yàn)與之前研究中MGF處理細(xì)胞方式存在差異，因此，本文分別選擇MGF持續(xù)處理與分化培養(yǎng)前一次性預(yù)處理MSCs，并檢測(cè)MSCs的成骨分化現(xiàn)象。結(jié)果顯示，MGF

12、一次性預(yù)處理提高了MSCs的成骨分化能力，而持續(xù)性的MGF處理反而抑制了MSCs的成骨分化能力，表現(xiàn)出MGF處理方式的依賴(lài)性。
　　綜上所述，本文證實(shí)嚴(yán)重的低氧微環(huán)境會(huì)顯著性地抑制了MSCs的細(xì)胞活力，改變了細(xì)胞形態(tài)，并降低了細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)及成骨分化能力，嚴(yán)重阻遏了骨修復(fù)進(jìn)程。通過(guò)MGF的預(yù)處理后，MSCs的細(xì)胞活力得到有效恢復(fù)，細(xì)胞形態(tài)、增殖、遷移與成骨分化能力均顯著性地提升。除此之外，MGF預(yù)處理有效地減弱了嚴(yán)重低氧對(duì)MSC