低氧預(yù)處理MSCs通過Pim-1高表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究在低氧預(yù)處理的不同培養(yǎng)條件及不同處理時(shí)間的大鼠骨髓MSCs的Pim-1、Akt以及與之相關(guān)的凋亡蛋白（Bcl-2）、抗凋亡蛋白（Caspase-3、Bax）的表達(dá)量，并比較它們之間的變化趨勢(shì)。研究低氧預(yù)處理后MSCs的抗凋亡能力、移植后細(xì)胞的存活率及對(duì)心功能的影響。初步探討經(jīng)低氧預(yù)處理的MSCs抗凋亡的機(jī)制。
　　方法：將第三代的MSCs置入直徑6cm的培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)共分為六組：正常培養(yǎng)細(xì)胞組（對(duì)照組）；低氧條件下用正常

2、培養(yǎng)液孵育細(xì)胞6h（HPC6h）；低氧條件下用正常培養(yǎng)液孵育細(xì)胞12h（HPC12h+FBS)；低氧條件下用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞12h（HPC12h)；低氧條件下用正常培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h（HPC24h+FBS)；低氧條件下用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h（HPC24h)。低氧預(yù)處理后通過q-PCR法檢測(cè)每組Pim-1、Bcl-2、Caspase-3及Bax的表達(dá)量；用Western Bolt法檢測(cè)低氧預(yù)處理組及Pim-1抑制劑

3、組在不同低氧時(shí)間（6h，12h，24h）Pim-1，t-Akt及p-Akt的表達(dá)情況；用流式細(xì)胞分析法測(cè)定低氧預(yù)處理組、Pim-1抑制劑組及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況；用Transwell法測(cè)定低氧預(yù)處理組、Pim-1抑制劑組及對(duì)照組的細(xì)胞遷移能力；用JC-1試劑盒檢測(cè)低氧預(yù)處理組、Pim-1抑制劑組及對(duì)照組的細(xì)胞的線粒體膜電位。挑選約300-350g的雌性SD大鼠24只隨機(jī)分為三組（對(duì)照組、低氧預(yù)處理組及Pim-1抑制劑組）行前降支結(jié)扎術(shù)。

4、術(shù)后一周開胸在結(jié)扎線周邊區(qū)域注射經(jīng)DiI染色后的各組干細(xì)胞。細(xì)胞移植后一周每組隨機(jī)取三只處死，取出心臟行石蠟切片，計(jì)數(shù)在心梗區(qū)域存活的干細(xì)胞，并比較各組干細(xì)胞的存活情況。行心梗模型的SD大鼠，在術(shù)前、術(shù)后三天、細(xì)胞移植后一周以及移植后一個(gè)月（每組剩余五只）行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，評(píng)估大鼠的心功能情況。
　　結(jié)果：q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在無血清的培養(yǎng)液條件下低氧預(yù)處理12h，Pim-1蛋白激酶的表達(dá)量達(dá)到峰值，與其他各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

5、P<0.05）?？沟蛲鲆蜃覤cl-2的變化與Pim-1的改變同步。凋亡因子Caspase-3及Bax的變化與Pim-1的改變相反（P<0.05）。Western Bolt檢測(cè)結(jié)果顯示，t-Akt的濃度和低氧預(yù)處理的時(shí)間及培養(yǎng)液條件無關(guān)，t-Akt的濃度保持恒定，而p-Akt的濃度隨著低氧預(yù)處理的時(shí)間及培養(yǎng)液的條件不同有所變化。Pim-1在低氧預(yù)處理12h時(shí)的濃度最高，在相同處理時(shí)間下，加入抑制劑組均較無抑制劑組的濃度低。而且p-Akt的

6、表達(dá)與Pim-1的表達(dá)變化趨勢(shì)一致，Pim-1抑制劑亦可以部分抑制p-Akt（P<0.05）。流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡情況及Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示低氧預(yù)處理組的抗凋亡能力及遷移能力最強(qiáng)（P<0.05）。JC-1試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示低氧預(yù)處理組細(xì)胞線粒體膜電位高于對(duì)照組及Pim-1抑制劑組。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示移植后一周低氧預(yù)處理組的干細(xì)胞存活率最高（P<0.05）。心超檢查結(jié)果顯示術(shù)前，術(shù)后三天及細(xì)胞移植后一周大鼠心