RNA干擾技術(shù)抑制宮頸癌細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子-1表達(dá)的研究.pdf

1、目的: 利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，使用特異的靶向于HIF-1基因的小干擾RNA（siRNA）作用于表達(dá)HIF-1陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞株SiHa，以了解siRNA對(duì)HIF-1基因的特異性抑制作用，為使用RNAi技術(shù)治療宮頸癌的可行性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1.分別構(gòu)建針對(duì)HIF-1基因的四個(gè)siRNAH1、H2、H3、H4以及陰性對(duì)照（Negative Control）和陽(yáng)性對(duì)照（Human GAPDH）siRN

2、A，鑒定無(wú)誤后均借脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株SiHa。使用帶GFP熒光標(biāo)記的siRNA，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，測(cè)得轉(zhuǎn)染效率。 2.用靶向于GAPDH的siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照，分別檢測(cè)常氧和低氧條件下培養(yǎng)的各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48hGAPDH的mRNA表達(dá)情況。 3.RT-PCR和Western Blotting方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后常氧和低氧培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)變化，篩選出抑制率最高的siRNA。 4.將篩選出的s

3、iRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，RT-PCR和Western Blottrng方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后常氧和低氧培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞中24、48、72及96小時(shí)mRNA和蛋白的表達(dá)變化，驗(yàn)證RNAi作用的時(shí)效性及特異性。 結(jié)果: 1.熒光倒置顯微鏡照片顯示，SiHa細(xì)胞在常氧和低氧條件下，均在siRNA終濃度為30nM時(shí)熒光最強(qiáng)，說(shuō)明此時(shí)siRNA進(jìn)入細(xì)胞較多，轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)到80％以上。 2.以β-actin作為內(nèi)參，常氧

4、及低氧培養(yǎng)時(shí)β-actin組β-actinmRNA的表達(dá)均無(wú)明顯變化，GAPDH組中GA-GA組的GAPDH mRNA的表達(dá)均比空白-GA及NC-GA組明顯下降（p<0.05）。 3.在本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染后RT-PCR和Western Blotting結(jié)果提示：針對(duì)HIF-1構(gòu)建的四個(gè)siRNA對(duì)HIF-1基因的干擾效率不同，其中H2siRNA引起常氧和低氧培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞中HIF-1表達(dá)水平的下降最顯著（P<0.05），根據(jù)試驗(yàn)

5、結(jié)果，選擇對(duì)HIF-1抑制率最高的H2siRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 4.將H2siRNA轉(zhuǎn)染常氧和低氧培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞，均引起靶基因特異、高效性抑制，轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h及96h均可觀察到HIF-1基因的顯著性降低，均以48h時(shí)下降最顯著（P<0.05）?？梢?jiàn)抑制作用至少維持到轉(zhuǎn)染后96h，對(duì)對(duì)應(yīng)的非靶基因無(wú)明顯抑制作用。 結(jié)論: HIF-1siRNA可通過(guò)靶向性抑制HIF-1基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)