RNA干擾表達(dá)載體抑制宮頸癌HPV16-E6基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的：探討RNA干擾表達(dá)載體(smallinterferenceRNAexpressionvector)對(duì)宮頸癌細(xì)胞中HPV16-E6基因的抑制作用，通過體外實(shí)驗(yàn)和雌性裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)了解我們構(gòu)建的載體能否特異性的沉寂宮頸癌細(xì)胞中的HPV16-E6基因及其時(shí)效性。 方法： 1.利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成含有針對(duì)HPV16-E6基因特定序列的56nt寡核苷酸片段，并將其定向克隆入真核表達(dá)載體，得到重組質(zhì)粒E6-1、E6-

2、2、E6-3。 2.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染宮頸癌caski和siha細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選獲得陽性克隆株。應(yīng)用熒光定量PCR(fluorescencequantitativePCR)技術(shù)及流式細(xì)胞儀(flowcytometry)檢測轉(zhuǎn)染前后及不同時(shí)間點(diǎn)HPV16-E6mRNA的變化、HPV16-E6蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的情況。 3.通過細(xì)胞生長曲線及克隆形成試驗(yàn)了解轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。 4.裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞成瘤

3、，不同時(shí)間點(diǎn)測定腫瘤體積的差異，腫瘤組織切片免疫組化衡量HPV16-E6蛋白表達(dá)變化和腫瘤細(xì)胞凋亡TUNEL檢測，評(píng)價(jià)體內(nèi)環(huán)境中RNAi表達(dá)載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。 結(jié)果： 1.利用PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，DNA測序證實(shí)特異性針對(duì)HPV16-E6基因的RNA干擾表達(dá)載體己成功構(gòu)建。 2.重組質(zhì)粒E6-1、E6-2、E6-3轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得陽性克隆細(xì)胞株，它們HPV16-E6mRNA的量分別相當(dāng)

4、于caski細(xì)胞的18.59％、10.43％、28.76％；蛋白表達(dá)抑制率分別為82.1％、98.1％、89.4％。重組質(zhì)粒E6-2對(duì)CaSki細(xì)胞E6基因的抑制作用更有效。 3.重組質(zhì)粒E6-1、E6-2、E6-3轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得陽性克隆細(xì)胞株，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率分別為2.9％、15.1％、12.6％。重組質(zhì)粒E6-2能更明顯的促進(jìn)CaSki細(xì)胞的凋亡。 4.重組質(zhì)粒E6-1、E6-2、E6

5、-3轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得陽性克隆細(xì)胞株，檢測它們HPV16-E6mRNA的量分別相當(dāng)于SiHa細(xì)胞的79.52％，87.87％，71.95％；E6蛋白的抑制率分別為24.61％、49.96％、40.01％。三個(gè)重組質(zhì)粒對(duì)SiHa細(xì)胞HPV16-E6基因無明顯的抑制作用。 5.重組質(zhì)粒E6-2轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞的陽性克隆株繼續(xù)培養(yǎng)，于第0、2、4、6、8周檢測HPV16-E6mRNA的量分別相當(dāng)于caski細(xì)胞的1

6、0.43％、29.27％、34.11％、48.25％、90.05％；HPV16-E6蛋白表達(dá)抑制率分別為：98.1％、87.6％、81.3％、72.5％、25.5％；細(xì)胞凋亡率分別為15.1％、11.5％、7.7％、1.7％、1.9％。重組質(zhì)粒E6-2對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞HPV16-E6基因的抑制效果可以維持4周以上。 6.空表達(dá)載體P0轉(zhuǎn)染CaSki、siha細(xì)胞后在任何時(shí)間點(diǎn)對(duì)HPV16-E6mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)和細(xì)胞的

7、凋亡都無明顯影響。 7.細(xì)胞生長曲線和平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒E6-2能明顯抑制CaSki細(xì)胞的增殖，空表達(dá)載體P0對(duì)細(xì)胞的增殖無明顯影響。 8.重組質(zhì)粒E6-2使宮頸癌CaSki細(xì)胞體內(nèi)成瘤時(shí)間延長，腫瘤體積及重量明顯小于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組，免疫組化顯示HPV16-E6蛋白表達(dá)明顯受抑，腫瘤組織壞死和細(xì)胞凋亡增加。 結(jié)論：RNAi表達(dá)載體對(duì)外源性的HPV16病毒E6基因進(jìn)行干擾是成功的，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)