RaGA基因內(nèi)含子的人工剪除及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、當(dāng)今世界能源短缺和環(huán)境污染已成為限制社會(huì)的發(fā)展進(jìn)步的重要問(wèn)題，與其它化石燃料相比，乙醇具有可再生、提供清潔的燃燒和不產(chǎn)生溫室氣體等優(yōu)點(diǎn)，乙醇作為替代能源已逐步被人們所認(rèn)識(shí)，成為解決上述問(wèn)題的有效途徑之一。目前以淀粉為原料高效率發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，主要通過(guò)遺傳工程構(gòu)建能夠直接發(fā)酵生淀粉產(chǎn)生乙醇的工程微生物，提高乙醇的產(chǎn)量。葡萄糖淀粉酶是轉(zhuǎn)化淀粉為葡萄糖、果糖糖漿的重要工業(yè)用酶。本研究的目的在于克隆少根根霉葡萄糖淀粉酶基因，并建立酶活檢測(cè)體系，為

2、采用shuffling分子進(jìn)化技術(shù)篩選高活性基因葡萄糖淀粉酶，以及構(gòu)建一步發(fā)酵生淀粉生產(chǎn)乙醇的釀酒酵母工程菌株奠定基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)已發(fā)表的米根霉葡萄糖淀粉酶序列，設(shè)計(jì)引物從少根根霉葡萄糖淀粉酶(RaGA)基因組中擴(kuò)增得到根霉葡萄糖淀粉酶基因(含內(nèi)含子)。設(shè)計(jì)一系列引物，通過(guò)PCR方法在體外將該基因中四個(gè)內(nèi)含子剪接除，獲得少根根霉葡萄糖淀粉酶基因編碼序列，克隆到pMD-T載體中獲得中間載體pUC-RaGA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增并

3、測(cè)序。從pUC-RaGA載體上用XhoⅠ和EcoRⅠ限制酶切下1.7kb DNA片段，將其以正確的讀碼框克隆到畢赤酵母整合型表達(dá)載體pPIC9的α-因子下游。重組質(zhì)粒pPIC9-RaGA經(jīng)過(guò)Bg1Ⅱ酶切、線性化后用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化組氨酸缺陷型畢赤酵母GS115-菌株，通過(guò)同源重組將外源基因插入到其基因組5'AOX1(醇氧化酶)啟動(dòng)子的下游。經(jīng)營(yíng)缺陷養(yǎng)篩選得到的缺陷恢復(fù)型轉(zhuǎn)化子，經(jīng)0.75％濃度甲醇誘導(dǎo)72小時(shí)后，液體培養(yǎng)基上清液中檢測(cè)到葡萄