TNF-α通過microRNAs導致骨質疏松中骨髓間充質干細胞分化缺陷的機制研究.pdf

1、【背景】
　　絕經后骨質疏松是最常見的骨質疏松，主要表現(xiàn)為絕經后出現(xiàn)的骨密度降低、骨微結構破壞和力學性能減退?？稍斐煞菓π怨钦鄹甙l(fā)，是危害中老年女性健康和生命的主要退行性疾病之一。骨質疏松發(fā)生的根本原因是破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨形成間的平衡破壞。以往對于骨質疏松的研究主要集中于終末分化的功能細胞。但近期研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞（ Bone marrow-derived mesenchymal stem cells

2、，BMSCs）作為成骨前體細胞的來源，在骨發(fā)育、改建和修復再生中均發(fā)揮重要作用。已有研究證實，在骨質疏松中BMSCs的成骨分化能力下降，是導致骨形成缺陷的重要原因。但是引起B(yǎng)MSCs分化功能異常的機制亟待闡明。
　　最新研究表明，雌激素主要通過間接作用影響骨形成。雌激素對于輔助性 T細胞等免疫細胞發(fā)揮重要的調控作用，其缺乏后引起的炎性因子增加是骨質疏松發(fā)生的關鍵致病因素。其中，腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis fact

3、or-alpha，TNF-α）是最主要的炎性因子之一，通過基因敲除或中和抗體等方法抑制TNF-α可有效預防雌激素缺乏所致骨質疏松。此外，TNF-α已被證實可以抑制BMSCs的成骨分化，但是因為TNF-α作用廣泛、下游信號通路復雜，其具體的分子信號途徑尚不清楚。
　　微小RNA（microRNA，miRNA）作為基因表達的重要調控手段，近年來被證實在BMSCs分化中扮演關鍵角色?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個miRNA通過作用于成骨關鍵轉錄因子和信號

4、分子調控BMSCs成骨分化進程。同時，在腫瘤、心血管疾病、神經退行性疾病等多種老年性疾病中均觀察到特定 miRNA的表達變化，并參與了疾病的發(fā)生發(fā)展進程。但是骨質疏松過程中BMSCs中miRNA表達是否發(fā)生改變，其改變與骨質疏松發(fā)生是否相關等重要問題均有待解答。
　　【目的】
　　本研究擬利用 microRNA高通量芯片檢測技術，結合分子生物學和細胞生物學研究方法，探索TNF-α抑制BMSCs成骨分化的分子途徑，明確miRN

5、A在其中的作用及機制，為深入認識絕經后骨質疏松的發(fā)生機制、探尋新的治療靶點提供實驗依據。
　　【方法】
　　1、通過卵巢切除（Ovariectomy，OVX）手術建立雌激素缺乏骨質疏松小鼠模型，利用microCT和組織學檢測明確其骨量變化；
　　2、通過體外成骨分化實驗，利用茜素紅染色和Realtime RT-PCR檢測成骨標志基因，明確OVX小鼠來源BMSCs成骨分化能力改變；
　　3、利用ELISA檢測明確T

6、NF-α在OVX術后的水平變化；
　　4、利用Western blot檢測TNF-α下游激活的信號通路；
　　5、利用siRNA阻斷NF-κB信號通路進行缺失性功能研究；
　　6、通過miRNA高通量芯片篩查尋找在OVX及SHAM BMSCs中差異性表達的miRNA；
　　7、利用特定miRNA mimics和inhibitor轉染進行獲得/缺失性功能實驗，用以確定miR-3077-5p和miR-705在BMSC

7、s分化中的作用；
　　8、利用生物信息學分析尋找miRNA作用的靶基因；
　　9、采用Western blot檢測結合熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miRNA對靶基因的直接作用；
　　10、利用雌激素體內注射和體外處理明確miR-3077-5p和miR-705是否直接受雌激素調控；
　　11、利用重組TNF-α和TNF-α中和抗體體內注射，明確TNF-α對miR-3077-5p和miR-705表達的調控作用及其激活的信號通

8、路；
　　12、利用TNF-α體外處理，研究TNF-α調控miR-3077-5p和miR-705表達的分子信號機制；
　　13、利用2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFH-DA）標記BMSCs內氧自由基（reactive oxygen species，ROS），并通過熒光顯微鏡和流式細胞術進行檢測；
　　14、利用抗氧化劑NAC明確ROS對于BMSCs成骨分化的作用；
　　15、利用免疫組化檢測骨質疏松后松質骨

9、中叉頭結合蛋白O亞家族1（FOXO1）的表達；
　　16、利用FoxO1 siRNA干擾和慢病毒過表達技術，明確FOXO1在BMSCs抗氧化防御中的作用；
　　17、通過antogomir體內注射體內下調miR-705的表達，以體內驗證miR-705的功能及其作用靶基因；18、利用染色質免疫共沉淀技術明確NF-κB信號通路是否直接調控miR-705的轉錄。
　　【結果】
　　1．骨質疏松中TNF-α抑制BMSCs

10、成骨分化
　　OVX術后3mon，BMSCs成骨分化能力較假手術組（Sham surgery，SHAM）顯著下降。而血液中TNF-α水平在雌激素缺乏后明顯上升，體外實驗證實過量的TNF-α抑制 BMSCs成骨分化。進一步信號通路檢測發(fā)現(xiàn) TNF-α并不激活凋亡通路，而激活NF-κB信號通路。利用IkkasiRNA抑制NF-κB通路后可有效恢復OVX BMSCs的成骨分化，并阻斷TNF-α對BMSCs成骨分化的抑制作用。
　　

11、2．TNF-α通過上調miR-3077-5p表達抑制BMSCs成骨分化
　　miRNA高通量芯片篩查發(fā)現(xiàn)10個miRNA在SHAM及OVX BMSCs中呈差異性表達，其中miR-3077-5p差異最為顯著。研究發(fā)現(xiàn)miR-3077-5p在OVX BMSCs和骨組織中表達異常升高，雌激素治療可降低其在骨組織中表達，但體外雌激素處理卻促進miR-3077-5p表達；而TNF-α顯著促進miR-3077-5p表達，說明雌激素缺乏后間接通

12、過TNF-α提高miR-3077-5p的表達。此外，miR-3077-5p在骨組織中表達豐度高，隨BMSCs成骨分化進程顯著下降，功能學研究證實miR-3077-5p抑制BMSCs成骨分化，主要通過直接結合于成骨關鍵轉錄因子Runx2 mRNA3‘非翻譯區(qū)（UTR）發(fā)揮作用。抑制miR-3077-5p有效恢復OVX BMSCs的成骨功能低下，并部分拮抗TNF-α的抑制成骨分化作用。
　　3．TNF-α通過導致氧化應激間接抑制BMS

13、Cs成骨分化
　　通過體內外實驗證實，骨質疏松中TNF-α的升高導致BMSCs中ROS水平升高，抑制BMSCs成骨分化。其氧化應激是由于SOD2、CAT等抗氧化酶表達減少、抗氧化防御缺陷所導致。FOXO1在骨質疏松骨組織及BMSCs中表達均下降。通過獲得/缺失性功能實驗證實 FOXO1促進 Sod2、Cat基因表達，發(fā)揮關鍵的抗氧化作用。TNF-α抑制FOXO1的蛋白表達，導致OVX BMSCs氧化損傷，而過表達FOXO1可減輕O

14、VX和TNF-α所致的氧化損傷，恢復BMSCs的成骨分化功能。
　　4．TNF-α通過上調miR-705導致持續(xù)性氧化損傷
　　TNF-α并不直接調控FoxO1基因轉錄。體內、體外實驗證實TNF-α促進miR-705表達。結合生物信息學分析、獲得/缺失性功能實驗、熒光素酶報告體系證實miR-705可結合于FoxO1 mRNA3‘UTR抑制其表達。下調miR-705可提高BMSCs中FOXO1蛋白水平、Sod2和Cat mRN

15、A表達，并減輕氧化損傷。信號通路研究證實TNF-α通過激活NF-κB信號通路，促進P65結合于miR-705啟動子激活其轉錄。此外，ROS能夠進一步活化NF-κB通路提高miR-705表達，形成NF-κB-miR-705-FOXO1-ROS正反饋回路。TNF-α長期刺激可導致BMSCs持續(xù)性的氧化損傷和成骨分化缺陷。
　　【結論】
　　1．TNF-α是導致絕經后骨質疏松中BMSCs介導的骨形成缺陷的重要因素。雌激素缺乏后導致

16、TNF-α水平升高，過量的TNF-α一方面通過抑制成骨關鍵轉錄因子Runx2的表達直接抑制BMSCs的成骨分化，另一方面通過抑制FOXO1介導的抗氧化防護機制，造成BMSCs氧化損傷，從而間接的抑制BMSCs成骨分化功能。
　　2．絕經后骨質疏松來源 BMSCs中部分 miRNA的表達發(fā)生顯著改變，是導致BMSCs成骨分化異常的重要原因。而TNF-α可通過影響特定miRNA的表達發(fā)揮抑制BMSCs成骨分化的作用。通過抑制其中miR

17、-3077-5p和miR-705的過量表達，可有效拮抗TNF-α對BMSCs成骨分化的抑制作用，并恢復OVX BMSCs的成骨分化能力，提示miRNA介導的轉錄后調控異常在絕經后骨質疏松發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　3．TNF-α通過NF-κB信號通路引起miR-3077-5p表達升高，過量的miR-3077-5p通過直接結合于Runx2 mRNA3’UTR，從轉錄后調控水平降低RUNX2蛋白水平，直接抑制BMSCs成骨分化。