骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型的建立及其在環(huán)境化學(xué)物骨質(zhì)損傷機(jī)制研究中的應(yīng)用.pdf

1、目的 1、建立和完善小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的體外培養(yǎng)體系，最大限度地獲得BMSCs。2、建立BMSCs的體外誘導(dǎo)分化模型。3、探討氟化鈉和酒精對間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用的機(jī)制，從而為防治氟骨病和酒精引起的股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松等損傷機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。 方法 1、無菌取C57／BL6小鼠骨髓，用全骨髓培養(yǎng)方法體外擴(kuò)增BMSCs，免疫組織化學(xué)染色鑒定BMSCs的

2、陽性表面標(biāo)志物CD90和陰性表面標(biāo)志物的CD34，繪制細(xì)胞的生長曲線。2、以含地塞米松、β-磷酸甘油鈉和維生素C的a-MEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，分別于不同時間收獲細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞的早、中、晚期指標(biāo)鑒定。以含地塞米松和胰島素的a-MEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)BMSCs向脂肪細(xì)胞方向分化，油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞。3、分別用含不同濃度的NaF、Et和Ach的基礎(chǔ)培養(yǎng)液染毒細(xì)胞，3天后收獲細(xì)胞行MTT試驗、c-fos免疫組織化學(xué)染色檢測

3、毒物對細(xì)胞的毒性；分別用含NaF、Et或Ach的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液染毒細(xì)胞，于3，8，15天后分別行ALP含量測定，VEGF、TAZ、OPG、Collagen type I、PPAR γmRNA的定量PCR實驗，以及基質(zhì)鈣含量的測定。15天后行油紅O染色計數(shù)脂肪細(xì)胞。 結(jié)果 1、該方法分離獲得的BMSCs細(xì)胞活性好，增殖能力旺盛，在經(jīng)歷2天的生長潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛增殖期，且能在體外長期培養(yǎng)(3個月)，但是此時細(xì)胞增殖能力減弱，鏡

4、下可見許多衰老死亡細(xì)胞，形念較差，且可見許多類似成骨細(xì)胞和脂肪滴出現(xiàn)。表面標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞CD90陽性，CD34陰性。2、成骨誘導(dǎo)分化實驗結(jié)果顯示于不同時間點檢測成骨細(xì)胞的早、中、晚期指標(biāo)ALP、ColI和基質(zhì)鈣沉積均顯著增加，有統(tǒng)計學(xué)差異。脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化實驗結(jié)果顯示BMSCs在脂肪誘導(dǎo)5～6天后，即可見有些細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小的脂滴，繼而聚集成大的脂肪滴，細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞變圓，油紅O染色呈陽性結(jié)果。3、MTT檢測發(fā)現(xiàn)乙

5、醇濃度在100mmol／L以上時表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象；乙醛呈雙相作用，即乙醛在2.0mmol/L以上時抑制細(xì)胞增殖，在0.036mmol／L以下時促進(jìn)細(xì)胞增殖。c-fos蛋白免疫組織化學(xué)實驗顯示乙醇在25、100mmol／L時分別為降低和增加c-fos蛋白水平，50mmol／L時與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。乙醛在0.036mmol／L時抑制c-los蛋白水平，在0.18、0.90mmol／L時差異無統(tǒng)計學(xué)意義。乙醇、乙醛及成骨誘導(dǎo)因子對

6、細(xì)胞的總蛋白水平均無顯著影響。成骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的VEGF、PPARγ 、TAZ等多種基因的mRNA水平和成骨細(xì)胞的功能指標(biāo)均上調(diào)，乙醇能抑制BMSCs分化前后ALP、ColI和胞外基質(zhì)鈣沉積，促進(jìn)成骨誘導(dǎo)分化前后脂肪細(xì)胞的分化，上調(diào)脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因PPARγ的mRNA，下調(diào)調(diào)控BMSCs成脂與成骨分化的基因TAZ mRNA表達(dá)水平：降低血管生成因子VEGF和OPG mRNA。乙醛處理后BMSCs成骨分化前后的ALP、鈣沉積量與相

7、應(yīng)對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，但是ColI mRNA的水平被大幅度的抑制，BMSCs分化前的VEGF無顯著影響，PPAR γ基因上調(diào)，成骨分化時乙醛處理后細(xì)胞VEGF、TAZ和OPG的基因表達(dá)降低，脂肪細(xì)胞數(shù)量顯著增加。4、NaF在10<'-3>mol／L以上抑制細(xì)胞增殖，低于此濃度促進(jìn)細(xì)胞增殖。在低濃度10<'-5>mol／L時NaF抑制c-fos蛋白水平，在10<'-4>、5x10<'-4>mol／L時差異無統(tǒng)計學(xué)意義。NaF對細(xì)胞的

8、總蛋白水平也無顯著影響。成骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的VEGF、PPAR γ、 TAZ等多種基因的mRNA水平和成骨細(xì)胞的功能指標(biāo)均上調(diào)，NaF處理后BMSCs成骨分化前的ALP與相應(yīng)對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，但是成骨分化后的ALP與鈣沉積量則顯著降低。Col I、PPARγmRNA的水平在成骨分化前后均被NaF抑制，NaF處理后BMSCs成骨分化前的VEGF、TAZ無顯著影響，脂肪細(xì)胞數(shù)量增加，成骨分化時細(xì)胞VEGF、TAZ的基因表達(dá)均降低，但是

9、OPG基因表達(dá)無顯著影響。 結(jié)論1、本實驗采用的BMSCs體外分離培養(yǎng)方法成功建立，能獲得大數(shù)量高純度且具有多向分化潛能的細(xì)胞，可以滿足毒理學(xué)實驗所需。 2、將BMSCs應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的骨質(zhì)損傷機(jī)制研究中可觀察到化學(xué)物早期的常規(guī)毒性和分化毒性，并可觀察到化學(xué)物對細(xì)胞不同分化階段的反應(yīng)和潛在的遠(yuǎn)期效應(yīng)，既節(jié)省實驗周期又減少了體內(nèi)試驗的多種混雜因素，能很好地滿足毒理學(xué)要求。2.1乙醇在10<'-3>3mol／L以上時可抑制B

10、MSCs的增殖，從而降低了向成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞數(shù)量，且此作用可能與c-fos蛋白有關(guān)。此外，乙醇不僅能抑制BMSCs的成骨分化潛能，促進(jìn)它向脂肪細(xì)胞分化，而且能阻礙分化后成骨細(xì)胞的功能與成熟，并抑制細(xì)胞分泌血管生成因子和破壞BMSCs成骨與成脂分化以及骨生成與吸收之間的平衡。乙醛對BMSCs的細(xì)胞毒性較乙醇大，此作用可能也與c-fos蛋白有關(guān)。乙醛的成骨抑制毒性發(fā)生較晚，主要在成骨分化期，但是毒性強(qiáng)度較乙醇大。它能特異性地抑制BMSCs