高氧損傷肺組織體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化的研究.pdf

1、本文對高氧損傷肺組織體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化進行了研究。文章分為兩個部分：
　　 第一章小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的體外分離擴增及鑒定。
　　 目的：探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)體外分離、純化及鑒定的方法。
　　 方法：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠MSCs，觀察不同代細胞的形態(tài)及生長情況，流式細胞術(shù)檢測表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106的表達情況，并對小鼠MSCs

2、進行純度測定。
　　 結(jié)果：小鼠MSCs原代培養(yǎng)接種24小時后僅可見少許細胞貼壁，72小時后貼壁細胞數(shù)量逐漸增多，可見一些集落形成，此時貼壁的細胞形態(tài)為長梭形。在細胞培養(yǎng)的2～6天細胞增殖較慢，7～12天細胞增殖較快，呈“旋渦樣”排列。細胞培養(yǎng)約兩周左右，可接近80％～90％融合，細胞形態(tài)較為均一。傳代后的小鼠MSCs24小時基本全部貼壁，呈梭形或星型樣形態(tài)，傳代培養(yǎng)后的細胞不再以集落方式生長，而呈均勻性分布生長。分離純化后所得

3、細胞活力為92.6±1.8％。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示第3代小鼠MSCs細胞均一性較好，在90％以上；CD34、CD45表達陰性，CD105、CD106表達陽性。
　　 結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合貼壁細胞培養(yǎng)法可成功培養(yǎng)出MSCs，所得小鼠MSCs活力及純度均較高，流式細胞技術(shù)可以鑒定體外分離培養(yǎng)的小鼠MSCs。
　　 第二章肺組織與骨髓間充質(zhì)干細胞體外非接觸共培養(yǎng)。
　　 目的：建立肺組織與MSCs體外非接觸共培養(yǎng)實驗

4、模型，探討高氧損傷肺組織體外對MSCs分化及遷移能力的影響。
　　 方法：出生1天新生小鼠置于60％氧濃度條件下飼養(yǎng)21天，建立支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia BPD)肺損傷模型。21天時脫頸椎處死取出肺組織，無菌條件下研磨、篩網(wǎng)過濾、胰酶消化、制備成肺組織單細胞懸液。共設(shè)定3組，transwell小室(PET膜孔徑為0.4um)下室中為第三代小鼠MSCs，上室中分別隨機放入高氧損傷肺組織

5、單細胞懸液(實驗組A)、正常肺組織單細胞懸液(實驗組B)及空白培養(yǎng)液(對照組)，進行體外非接觸共培養(yǎng)。共培養(yǎng)6天做劃痕實驗、transwell小室侵襲實驗，觀察共培養(yǎng)后各組MSCs遷移能力的變化。共培養(yǎng)8天進行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微下觀察各組共培養(yǎng)體系下室SP-C、AQP5免疫熒光表達情況。共培養(yǎng)8天采用實時定量(Real-time)PCR，2-△△Ct方法定量分析共培養(yǎng)體系下室MSCs中表面活性蛋白-C(SP-C)、水通道蛋白5

6、(AQP5)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)mRNA含量的表達。
　　 結(jié)果：吸入60％氧氣21天小鼠肺組織病理切片示：肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔直徑明顯擴大，肺泡數(shù)量減少，可見大面積肺泡融合，肺泡間隔增厚，大量間質(zhì)細胞增生，BPD高氧肺損傷模型建立成功。劃痕后培養(yǎng)12小時進行觀察，三組均僅有少量細胞爬行至劃痕中，24小時三組數(shù)目均有增加，但實驗組A增加較明顯，48小時實驗組B及對照組遷移細胞數(shù)量明顯少于實驗組A。Transwe

7、ll小室侵襲實驗：培養(yǎng)48小時后，對小室下表面上的細胞計數(shù)，發(fā)現(xiàn)實驗組A與實驗組B或?qū)φ战M相比較，穿過PET膜的細胞數(shù)目均有顯著性差異。提示損傷肺組織共培養(yǎng)可以促進MSCs遷移能力的提高。共培養(yǎng)8天時免疫熒光結(jié)果：實驗組A組可以見hoechst33342標記的藍色熒光，AQP5的紅色熒光，SP-C的綠色熒光；實驗組B和對照組都僅見到hoechst33342標記的藍色熒光，AQP5的紅色熒光，而未見到SP-C的綠色熒光。共培養(yǎng)8天時Rea

8、l-timePCR結(jié)果：SP-C mRNA在實驗組A存在表達，但實驗組B和對照組均未見有SP-CmRNA表達。AQP5 mRNA、TGF-β1 mRNA三組均有表達，實驗組A與實驗組B和對照組比較AQP5、TGF-β1 mRNA的表達水平明顯增加(P＜0.01)。但實驗組B組與對照組表達水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：成功建立BPD高氧肺損傷模型，以及體外非接觸共培養(yǎng)誘導小鼠MSCs分化為肺泡上皮細胞的實驗模型，并