骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高糖誘導(dǎo)β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)對(duì)長(zhǎng)期高糖損傷的β細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制。
　　方法:體外實(shí)驗(yàn)，大鼠胰島素瘤細(xì)胞(INS-1)在高糖(33.3 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)基中處理48小時(shí)，之后與BM-MSCs或大鼠成纖維細(xì)胞(208F)共培養(yǎng)12小時(shí)，再進(jìn)行下列檢測(cè):(1)由細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8)檢測(cè)INS-1細(xì)胞活性;(2)膜連蛋白Ⅴ/碘化丙啶(AnnexinⅤ/Propidium iodine)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

2、;(3)放射免疫法(RIA)檢測(cè)INS-1細(xì)胞的胰島素分泌情況;(4)免疫印記法(western blotting)檢測(cè)裂解的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase3)和兩種常用的自噬標(biāo)記物的表達(dá)，分別為Beclin1及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3);(5)綠色熒光蛋白標(biāo)記的LC3(GFP-LC3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至INS-1細(xì)胞以量化自噬;(6)應(yīng)用免疫熒光法及透射電鏡(TEM)分別檢測(cè)INS-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化;

3、(7)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)INS-1細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)及活性氧(ROS)生成量的變化。另外，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將BM-MSCs輸注到經(jīng)高脂喂養(yǎng)及小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠中。監(jiān)測(cè)大鼠血糖、胰島素及C-肽水平的變化。通過組織學(xué)染色、免疫熒光法及透射電鏡觀察大鼠胰島及β細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果:長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下的INS-1細(xì)胞，其細(xì)胞活性下降、細(xì)胞凋亡率增加、基礎(chǔ)胰島索分泌(BIS)與葡萄糖刺

4、激的胰島素分泌（GSIS）均受損。BM-MSCs共培養(yǎng)有效減輕了長(zhǎng)期高糖造成的這些損傷，而208F細(xì)胞共培養(yǎng)則無明顯效應(yīng)。與此同時(shí)，westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在與BM-MSCs共培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞中，Beclin1和LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯增加。免疫熒光染色及透射電鏡觀察的結(jié)果也說明BM-MSCs促進(jìn)了高糖環(huán)境下INS-1細(xì)胞中自噬體與自噬溶酶體的形成。但是，抑制自噬明顯削弱了BM-MSCs對(duì)長(zhǎng)期高糖損傷的β細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，

5、這就意味著BM-MSCs在一定程度上是通過增強(qiáng)自噬改善了高糖環(huán)境下β細(xì)胞的功能與存活。而且，與僅受到高糖處理的INS-1細(xì)胞相比，BM-MSCs改善了高糖環(huán)境下INS-1細(xì)胞中線粒體的功能，具體表現(xiàn)為MMP的恢復(fù)及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的下降，這在很大程度上是由于自噬清除了受損的線粒體。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，輸注BM-MSCs不僅能降低2型糖尿病大鼠血糖，還促進(jìn)了胰島及β細(xì)胞的修復(fù)。更重要的是，結(jié)果顯示輸注BM-MSCs使2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞中溶

6、酶體相關(guān)酶蛋白2（LAMP2）表達(dá)增加、自噬體及自噬溶酶體形成增多，同時(shí)伴隨著β細(xì)胞凋亡減少及胰島素顆粒數(shù)量的增加。
　　結(jié)論:
　　(1)與BM-MSCs共培養(yǎng)后可增強(qiáng)INS-1細(xì)胞自噬，從而保護(hù)INS-1細(xì)胞免受長(zhǎng)期高糖引起的損傷。
　　(2)輸注BM-MSCs亦可通過調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的治療機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，也為臨床應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞治療2型糖尿病提供了重要的理論依據(jù)。