骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠腎小管損傷的作用及其抗氧化機(jī)制的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　臨床上多種腎臟疾病均有不同程度的腎小管損傷，甚至在腎臟受損前已出現(xiàn)腎小管損傷。多種因素如缺血、缺氧、缺血再灌注、毒物、藥物等均可引起腎小管損傷，藥物損害造成腎小管損傷常見，如氨基糖甙類、頭孢菌素、二性霉素B、萬古霉素等。當(dāng)腎臟受缺氧、中毒、細(xì)胞炎性反應(yīng)因子、血漿蛋白或葡萄糖等因素作用后，腎小管會受到一定的損傷，從而引起腎小管功能受損，主要病理表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性、脫落和壞死，損傷較重時表現(xiàn)為急性腎小管

2、壞死。腎小管病變程度與腎臟疾病的發(fā)展、療效和預(yù)后密切相關(guān)，但腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)再生能力極其有限，迄今缺乏特效的治療手段，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）移植為腎小管損傷的治療帶來了希望。
　　BM-MSCs治療腎小管損傷的機(jī)制存在爭議，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腎小管損傷通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生機(jī)制和旁分泌機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。BM-MSCs遷入受損腎臟并分化為腎小管上皮細(xì)胞而修復(fù)，或通過 BM-MSCs與受損細(xì)胞融合而修復(fù)，而并非分化為腎小管上

3、皮細(xì)胞。旁分泌則通過上調(diào)抗炎因子及抑制炎癥因子水平而起修復(fù)作用。然而當(dāng)組織損傷時，機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激（OS）升高，抗氧化因子水平下降。因此，提高抗氧化因子水平能有效降低OS。BM-MSCs是否存在抗氧化機(jī)制，本課題將進(jìn)行相關(guān)的研究。并探討 BM-MSCs對腎小管損傷的作用。
　　本研究擬：（1）建立腎小管損傷模型，通過BM-MSCs移植治療腎小管損傷，觀察BM-MSCs對腎小管損傷的作用。（2）觀察BM-MSCs能否提高抗氧化因子過氧

4、化物歧化酶（SOD）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx）水平。（3）SOD、HO-1、Gpx水平與腎小管損傷修復(fù)是否具有相關(guān)性。觀察指標(biāo)：腎臟組織勻漿SOD、HO-1、Gpx水平，腎小管病理評分，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率(AI)、腎小管上皮細(xì)胞增殖（PCNA標(biāo)記指數(shù)），血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）白介素-10（IL-10）和丙二醛（MDA）水平。

5、r>　　目的：
　　探討B(tài)M-MSCs對大鼠腎小管損傷的作用及抗氧化機(jī)制，為BM-MSCs在臨床上治療腎小管損傷提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.選取3w-4w的體重80g-100g的大鼠斷頸處死后獲取 BM-MSCs。用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)及純化 BM-MSCs，BM-MSCs擴(kuò)增、傳代培養(yǎng)至第三代經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察、表面抗體鑒定、成骨及成脂誘導(dǎo)分化，確定培養(yǎng)細(xì)胞為BM-MSCs。選取第三代 BM-MSCs移植治療大鼠腎小管損

6、傷。
　　2.36只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和干預(yù)組，每組12只。模型組和干預(yù)組用GM100mg/kg·d腹腔注射7天，正常組用等體積生理鹽水腹腔注射。干預(yù)組用1ml生理鹽水重懸4×106 BM-MSCs，制成細(xì)胞懸液并注入尾靜脈，模型組及正常組用生理鹽水1ml注入尾靜脈。尾靜脈注射7天后，麻醉三組所有大鼠，取全血及腎臟標(biāo)本。血標(biāo)本離心后獲得血漿用比色法檢測SCr、BUN水平；血清標(biāo)本用ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、I

7、L-1β及抗炎因子IL-10；腎標(biāo)本用于病理、TNNEL、免疫組化檢測；腎臟組織勻漿用于檢測MDA水平及SOD、Gpx水平；實時熒光定量PCR法檢測HO-1 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1. BM-MSCs培養(yǎng)結(jié)果
　　1.1形態(tài)學(xué)上，BM-MSCs呈梭性或紡錘形。多次傳代后BM-MSCs形態(tài)學(xué)無明顯改變。
　　1.2表面抗體鑒定顯示BM-MSCs表面CD29、CD44陽性，CD45、CD34陰性。

8、>　　1.3體外能誘導(dǎo)BM-MSCs向骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化。
　　2. BM-MSCs對大鼠腎小管損傷的作用
　　2.1 SCr、BUN水平：干預(yù)組、模型組及正常組 SCr水平分別為145.00±18.49μmol/L、303.1±80.83μmol/L及99.65±13.69μmol/L，干預(yù)組SCr水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01;干預(yù)組、模型組及正常組BUN水平分別為6.14±1.29 mmol/L、13

9、.22±1.25 mmol/L及3.58±0.37 mmol/L，干預(yù)組BUN水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。
　　2.2腎小管病理評分：干預(yù)組2.58±0.51，模型組4.67±0.65，正常組0.17±0.4，干預(yù)組病理評分低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。
　　2.3 TNF-α、IL-1β、IL-10水平：干預(yù)組、模型組及正常組TNF-α水平分別為43.45±6.28 pg/ml、77.69

10、±9.34 pg/ml及24.25±3.42pg/ml。干預(yù)組TNF-α水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01；干預(yù)組、模型組及正常組IL-1β水平分別為459.13±56.97 pg/ml、819.21±120.33pg/ml及272.38±32.86 pg/ml，干預(yù)組IL-1β水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01；干預(yù)組、模型組及正常組IL-10水平分別為255.99±31.42 pg/ml、168.69±18.3

11、 pg/ml及138.38±9.7 pg/ml，干預(yù)組IL-10水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01。
　　2.4 AI:干預(yù)組、模型組及正常組的AI分別為0.31±0.15、8.84±4.09及2.69±1.07，干預(yù)組AI低于與模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。
　　2.5腎小管上皮細(xì)胞增殖（PCNA標(biāo)記指數(shù)）：干預(yù)組、模型組及正常組的PCNA標(biāo)記指數(shù)分別為7.94±2.74、2.66±0.78及0.05±

12、0.07，干預(yù)組PCNA標(biāo)記指數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。
　　2.6 MDA水平：干預(yù)組、模型組及正常組 MDA水平分別為2.36±0.27 nmol/mgprot、4.06±0.74 nmol/mgprot及1.63±0.29 nmol/mgprot，干預(yù)組MDA水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。
　　2.7 SOD、Gpx水平：干預(yù)組、模型組及正常組 SOD水平分別為267.73±16.

13、99 U/mgprot、216.36±7.30 U/mgprot及182.67±5.13 U/mgprot，干預(yù)組SOD水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；干預(yù)組、模型組及正常組 Gpx水平分別為79.74±12.15活力單位、42.65±8.74活力單位及4.11±0.51活力單位，干預(yù)組Gpx水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。
　　2.7 HO-1 mRNA表達(dá)水平（2-ΔΔCt值）：干預(yù)組、模型組及

14、正常組HO-1 mRNA水平分別為30.03±16.46、9.19±0.77及0.73±0.10，干預(yù)組HO-1 mRNA水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。
　　2.8相關(guān)性：HO-1、SOD、Gpx水平與腎小管損傷評分、SCr、BUN、TNF-α、IL-1β水平及細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；與 IL-10、PCNA標(biāo)記指數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)性亦具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。
　　結(jié)論：